白介素－23受体基因多态性与乙肝相关肝细胞癌的易感性研究＊

彭契六 覃彦平 易 珍 覃锦耀 谢 丽 李 山，＃ 秦 雪，＃

彭契六1，覃彦平2，易 珍1，覃锦耀1，谢 丽1，李 山1，＊，秦 雪1，＊

1广西医科大学第一附属医院检验科，南宁530021； 2广西柳州市红十字会医院检验科，柳州545001； ＊通讯作者

肝细胞癌（Hepatocell ular Carcino ma，HCC）是广西地区壮族人群高发恶性肿瘤［1］，乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染、黄曲霉毒素污染和饮用污水被认为是广西肝癌的重要危险因素［2］，但其确切机制尚未阐明。大量流行病学研究提示，慢性炎症感染与恶性肿瘤的发生发展密切相关［3，4］。乙肝相关HCC属于经典的炎症伴随肿瘤，炎症在乙肝相关HCC的发生发展中起着至关重要的作用［5］。白细胞介素23（IL－23）是一个拥有异二聚体结构的前炎症因子，可刺激人体内T细胞的增殖和γ－干扰 素 （IFN－γ）的 产 生；IL－23／IL－23 受 体 （IL－23R）参与Th17细胞免疫调节。Th17细胞是一类重要的CD4＋T细胞亚群，主要通过分泌IL－17 A等促炎因子参与炎症免疫反应。多项研究表明，IL－23 R基因多态性与多种炎性疾病如克罗恩病、炎性肠病以及银屑病等遗传易感性相关［6～8］。但与乙肝背景下炎性HCC是否相关，目前尚无定论。为此，本研究应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）技术检测了广西地区壮族人群乙肝表面抗原（Hbs Ag）阳性的 HCC患者IL－23R基因多态性，旨在探索IL－23 R基因多态性与 HCC的关系，为进一步研究HCC的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

所有研究对象均为相互间无血缘关系的广西地区壮族人群，选择2011年1月～7月在广西医科大学第一附属医院就诊和治疗的经肝组织病理学诊断为HCC、HBs Ag阳性且无其它器官恶性肿瘤史的患者作为病例组，病例组所有患者均未经化疗、放疗，无年龄限制；选同期来自该院健康体检，无肿瘤病史的HBs Ag阳性者作为对照组。两组均排除丙肝病毒（HCV）感染和其它原因导致的肝脏病变，如酒精性及代谢性肝病等。所有研究对象均采集外周血标本2 ml，EDTA抗凝，采集后立即置4℃保存备检。本研究经广西医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，所有样本均在患者签署书面知情同意书后收集。

1.2 实验试剂和仪器

引物由上海生工生物有限公司合成；Dream Taq TM Green PCR Master Mix（2x）试剂盒和限制性内切酶Mnll、HaeⅢ均由美国Fer mentas公司提供；Marker DP500TM由大连宝生物工程有限公司生产；溴化乙锭（EB）由美国Promega公司生产，北京普洛麦格生物技术有限公司提供；琼脂糖由北京普博斯生物科技有限公司提供。

PCR核酸扩增仪（DA－7600型）由中山大学达安基因股份有限公司生产；电泳仪由北京六一仪器厂生产；全自动凝胶成像系统为美国GENEGENIUS公司产品；高速低温离心机（RS－20型）为日本TOMY公司产品；双波长紫外分光光度计为美国PE公司产品；电子分析天平为日本津导公司产品；低温冰箱为中国海尔公司产品；恒温水浴箱为上海精宏实验设备有限公司产品。

1.3 研究方法

1.3.1 基因组DNA提取：采用酚－氯仿抽提法提取全血基因组DNA。

1.3.2 引物设计与合成：参照有关文献［3，9，10］设计3对引物，由上海生工生物有限公司合成。用于特异性 扩 增 IL－23 R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817。3个位点的引物序列见表1。

表1 IL－23 R基因多态性引物序列及反应条件

1.3.3 PCR扩增：IL－23R 的 PCR 扩增反应体系为25μl，其 中 含 10×PCR Buffer 2.5μl，2.5 mmol／L d NTPs 2.0μl，引物P1、P2各20 p mol，模板DNA 5.0μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，不足体积用灭菌双蒸水补足。置热循环仪（DA－7600型）中94℃预变性2 min；再按下列程序循环36次，即94℃变性30s，62.8℃／56℃／54℃ 退火 30s，72℃ 延伸30s；末次循环后，72℃ 延伸10 min。IL－23R 基因rs10889677、rs1884444、s11465817各位点的退火温度见表1。

1.3.4 扩增产物酶切：取PCR扩增产物10μl，10 U限制性内切酶（美国Fer mentas公司）于37℃酶切16h，反应终止后，消化片段在3%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后经紫外灯判断结果并拍照。

1.3.5 基因型鉴定：为保证基因型检测结果的准确性，随机抽取每个位点10%的样本送至上海生工生物有限公司进行测序验证。测序仪器为ABI－PRISM3730，采用Chromas软件分析DNA测序结果。酶切结果和测序结果吻合率均达100%。

1.4 统计学处理

以χ2检验比较人口学特征、吸烟和饮酒状况以及IL－23R 3个位点各基因型和等位基因频率在病例组和对照组之间分布的差异；采用拟合优度χ2检验对对照组的基因型分布进行 Hardy－Weinberg平衡检验，非条件Logistic回归模型计算比值比（Odds Ratios，OR）及其95%可信区间（ConfidenceIntervals，CI）表示相对危险度，采用 SHEsis软件推算IL－23R基因多态性3个位点单体型频率在病例组和对照组中的分布。所有统计检验均为双侧概率检验，所有数据分析均使用SPSS 13.0统计软件。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例组和对照组临床资料比较

病例组和对照组临床资料比较见表2，两组性别、吸烟史和饮酒史构成比差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组≥50岁患者的构成比高于对照组，差异有统计学意义（χ2＝15.165，P＜0.01）。

表2 病例组与对照组临床资料比较（n，%）

2.2 IL－23R基因型分析

IL－23 R基因rs10889677位点PCR扩增产物大小为216bp，根据限制性内切酶 Mnll酶切片段情况，其基因型有3种：AA型（216bp 1条带）、AC型（216bp、154bp、62bp 3条带）和 CC型（154bp、62bp 2条带）；IL－23 R基因rs1884444位点PCR扩增产物大小为132bp，根据限制性内切酶HaeⅢ酶切片段情况，基因型有3种：TT型（132bp 1条带）、TG型（132bp、106bp、26bp 3条带）和 GG 型（106bp、26bp 2条带）；IL－23R 基因rs11465817位点 PCR扩增产物大小为136bp，根据限制性内切酶HaeⅢ酶切片段情况，基因型有3种：AA型（136bp 1条带）、AC 型 （136bp、117bp、19bp 3 条 带），CC 型（117bp和19bp 2条带）。

2.3 对照组基因型分布频率

对照 组 IL－23R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817各基因型Har dy－Weinberg平衡吻合度检验结果表明，各基因型分布频率均符合Hardy－Weinber g遗传平衡定律（P＞0.05），说明研究对象具有群体代表性。

2.4 IL－23R各基因型、等位基因频率分布与HCC的关系

IL－23R 基 因 rs10889677、rs11465817 位 点AA、AC、CC基因型和A、C等位基因频率在病例组和对照组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）；病例组IL－23 R基因rs1884444位点TG基因型频率高于对照组（χ2＝6.798，P＜0.05），T、G等位基因频率在两组中分布差异亦有统计学意义 （χ2＝4.330，P＜0.05）。见表3。

2.5 IL－23R基因多态性与 HCC风险

在调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史等环境危险因素条件下，非条件Logistic回归模型分析结果显示，IL－23R 基因rs10889677、rs11465817位点携带AC、CC基因型个体与HCC患病风险无相关性（P＞0.05），rs1884444位点携带TG基因型个体罹患 HCC风险增加（校正 OR＝2.20，95%CI＝1.11～4.37，P＜0.05），GG基因型与患病风险无相关性（P＞0.05）。见表4。

表3 病例组和对照组IL－23 R基因各基因型、等位基因频率分布（n，%）

表4 IL－23 R基因多态性与HCC风险的非条件Logistic回归分析

2.6 单体型分析

使用SHEsis软件对IL－23 R基因rs10889677、rs1884444、rs11465817 3个位点进行单体型构建发现其存在 CGC、CGA、CTC、CTA、AGC、AGA、ATC、ATA等8种单倍体，病例组与对照组AGC单倍体分布差异有统计学意义（P＜0.05）；调整了性别、年龄、吸烟史、饮酒史等环境危险因素的非条件Logistic回归分析结果显示，AGC单体型携带者较其它非ATA单体型携带者发生HCC的风险明显提高（校正OR＝2.71，95%CI＝1.06～6.93，P＜0.05）。见表5。

3 讨 论

本研究首次探讨了广西地区HBs Ag阳性壮族人群IL－23R基因rs10889677、rs1884444、rs11465817位点多态性与HCC遗传易感性的关系，发现IL－23 R rs1884444 TG基因型可增加HCC的患病风险。进一步对HCC组和对照组进行单体型构建分析发现存在 CGC、CGA、CTC、CTA、AGC、AGA、ATC、ATA等8种单倍体，且HCC组与对照组相比，AGC单体型分布差异明显，提示该单倍体和与其关联的多态性位点可能存在协同效应，增强IL－23R的转录或表达，从而增加HCC的发病风险。

表5 HCC组和对照组IL－23R基因3个位点构成的单体型频率分布

IL－23／Th17细胞免疫轴是机体炎症免疫的重要组成部分。炎症反应涉及一系列促炎细胞因子、抑炎细胞因子以及多种趋化因子。有动物实验［11］表明促炎细胞因子对维持慢性炎症、促进肿瘤细胞生成、肿瘤微环境扩张和抑制肿瘤免疫监视等具有重要作用，特别是近几年发现的IL－23／IL－23R通路对维持Th17细胞表型稳定、促进其增殖以及细胞分泌等发挥重要作用［12］。Th17细胞是继Th1和Th2细胞系之后的第3类CD4＋Th细胞群，可分泌大量促炎因子如IL－17 A、IL－17F、IL－6、肿瘤坏死因子α（TNF－α）以及IL－25（IL－17E）等参与组织慢性炎症，其介导的免疫反应对抵抗外来病原体以及参与多种自身免疫性疾病过程发挥了重要作用。除此之外，有研究［13］揭示IL－23可以阻止 CD8＋T 细胞浸润肿瘤组织，从而导致肿瘤细胞逃避免疫监视。

乙肝背景下HCC属于经典的炎症伴随肿瘤，炎症贯穿于乙肝相关HCC的从始至终。本研究结果显示IL－23R rs1884444位点基因多态性与HCC易感性相关，表明IL－23R基因可能与某些炎症相关肿瘤的易感性相关。rs1884444位点位于IL－23 R第二外显子，主要负责编码IL－23R信号肽［14］。目前rs1884444的功能仍不明确，在线SNP分析工具Pupasuite3软件 （http：//pupasuite.bioinf o.cipf.es/）分析显示，rs1884444基因多态性可能干扰外显子剪接增强子的作用，导致外显子跳跃和错误剪接等。另一种可能的原因是该位点T→G突变导致mRNA稳定性增强，上调IL－23R表达，诱导Th1向Th17分化，大量分泌IL－17促进其它细胞因子合成增多，引起炎性免疫反应增强，从而提高某些炎性疾病如克罗恩病、炎性肠病和HCC的发病易感性。

综上所述，本研究通过病例－对照设计发现IL－23 R rs1884444基因多态性，TG基因型可能与广西地区HBs Ag阳性壮族人群HCC遗传易感性有关，携 带 IL－23 R 基 因 rs10889677、rs1884444、rs11465817多态性AGC单倍体人群HCC发病风险增高。但IL－23R基因多态性在HCC发病中的确切机制尚不清楚，有待进一步研究阐明。

1 Yang Y，Qiu XQ，Yu HP，et al.TNT－α－863 polymorphisms and the risk of hepatoceualar carcinoma［J］.Exp Ther Med，2012，3（3）：513～518.

2 Tao P，Zhi－Ming L，Tang－Wei L，et al.Associated factors in modulating aflatoxin B1－al bumin adduct level in three Chinese populations［J］.Dig Dis Sci，2005，50（3）：525～532.

3 Zhang Z，Zhou B，Zhang J，et al.Association of interleukin－23 receptor gene polymorphisms with risk of ovarian cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，2010，196（2）：146～152.

4 Chien MH，Hsin CH，Chou LS，et al.Interleukin－23 receptor polymorphism as a risk factor for oral cancer susceptibility［J］.Head Neck，2012，34（4）：551～556.

5 Martin M，Herceg Z.from hepatitis to hepatocellular carcinoma：a proposed model for cr oss－talk between infla mmation and epigeneticmechanisms［J］.Genome Med，2012，4（1）：8.

6 Wu Y，Lu Z，Chen Y，et al.Replication of association between interleukin－23 receptor（IL－23 R）and its ligand （IL－12B）polymorphisms and psoriasis in the Chinese Han population［J］.HumImmunol，2010，71（12）：1 255～1 258.

7 Lacher M，Schroepf S，Hel mbrecht J，et al.Association of the interleukin－23 receptor gene variant rs11209026 with Crohn's disease in Ger man children［J］.Acta Paediatr，2010，99（5）：727～733.

8 Duerr RH，Taylor KD，Brant SR，et al.A genome－wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene［J］.Science，2006，314（5804）：1 461～1 463.

9 Cargill M，Schrodi SJ，Chang M，et al.A large－scale genetic association study confir ms IL12B and leads to the identification ofIL23 R as psoriasis－risk genes［J］.Am J Hum Genet，2007，80（2）：273～290.

10 Chen J，Lu Y，Zhang H，et al.A nonsynony mous polymorphism in IL23 R gene is associated with risk of gastric cancer in a Chinese population［J］.Mol Carcinog，2010，49（10）：862～868.

11 Xu B，Feng NH，Li PC，et al.A functional polymorphism in Pre－mi R－146a gene is associated with prostate cancer risk and mature mi R－146a expression in vivo［J］.Prostate，2010，70（5）：467～472.

12 Berezikov E，Guryev V，van de Belt J，et al.Phylogenetic shadowing and computational identification of human micro RNA genes［J］.Cell，2005，120（1）：21～24.

13 Ford D，Easton DF，Stratton M，et al.Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families.The Breast Cancer Linkage Consortium［J］.Am J Hum Genet，1998，62（3）：676～689.

14 Kertesz M，Iovino N，Unnerstall U，et al.The role of site accessibility in micr o RNA tar get recognition［J］.Nat Genet，2007，39（10）：1 278～1 284.