LNA PCR检测骨髓增殖性疾病JAK2基因V617F突变＊

童永清 郑红云 李 锋 顾 剑 李 艳，＃

童永清1，2，郑红云2，李 锋2，顾 剑1，李 艳1，2，＊

武汉大学人民医院，武汉430060，1检验科； 2临床分子诊断中心； ＊通讯作者

酪氨酸激酶JAK2（Janus Tyr osine Kinase 2，JAK2）为非受体型即细胞内激酶，是JAK2基因编码的一种能调节红细胞生成的蛋白质，与JAK1、JAK3和 TYK2同属于JAK 家族［1］。研究发现，V617F突变位于JAK2的JH2假激酶区，该区域与JAK2活性的抑制有关。V617F突变时导致JAK2持续激活，从而导致不受控制的细胞持续增殖而引起骨髓细胞增多而导致骨髓增殖性疾病（Myeloprolif erative Diseases，MPD）的发生［2，3］。

MPD包括真性红细胞增多症（PV）、特发性骨髓纤维化（IMF）、原发性血小板增多症（ET）。WHO于2008年将JAK2基因V617F突变列为MPD的主要确诊指标之一［4］，同时JAK2基因V617F突变检测也是监测临床治疗疗效的分子靶标［5］。因此检测或监测 MPD患者JAK2基因V617F突变是十分重要的。本研究建立一种基于锁核 酸 PCR（Locked Nucleic Acid PCR，LNA PCR）方法检测JAK2基因 V617F突变，并探讨其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 样品

收集2010年5月～2011年10月在本院血液科确诊住院的68例MPD患者的EDTA抗凝外周血或骨髓标本2～3 ml。患者平均年龄27.3±9.1岁，男43例，女25例。其中PV 37例、ET 22例、IMF 9例。以上患者均符合WHO骨髓增生异常／骨髓增生性疾病的诊断标准［4］。

1.2 实验试剂及仪器

人基因组DNA提取试剂盒（Bl ood ＆Cell Culture DNA Mini Kit）由凯杰生物技术有限公司（深圳）提供（货号：13323）；DNA PCR扩增试剂（2×Taq PCR Master Mix）由上海莱枫生物技术有限公司提供（货号：PT102－02）；DNA 测序试剂盒（The Big Dye Ter minator v3.1 Cycle Sequencing Kit）由Life Technologies公司提供（货号：4337456）；DNA Mar ker由上海莱枫生物技术有限公司提供（货号：PM101－02）。ND－2000超微量核酸蛋白测定仪（美国Nano Drop公司生产）；9700 PCR扩增仪（Life Technologies公司生产）；DNA凝胶电泳仪（北京六一仪器厂生产）；DNA测序仪（Life Technol ogies公司生产）；凝胶成像系统（法国VL公司生产）。

1.3 检测方法

1.3.1 人基因组DNA提取：取采集的MPD患者EDTA抗凝外周血或骨髓100μl，按照人基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取人基因组DNA，ND－2000超微量核酸蛋白测定仪测定A260／A280比值，分析提取基因组DNA纯度，同时测定提取基因组DNA含量。所提基因组DNA放置于－20℃备用。

1.3.2 JAK2基因V617F突变LNA PCR检测引物及LNA设计：根据美国国家生物技术信息中心提供的JAK2基因序列（NG＿009904.1）及 V617F突变所在的位置，设计引物扩增的DNA片段包含V617F突变位点，同时设计与野生型V617 V结合的LNA。包含V617位点的JAK2基因扩增上游引物5’－TCC TCA TCT ATA GTC ATG CTG AAA G－3’，下 游 引 物 5’－TCA GTT TCA AAA ATA CTT AAC TCC TG－3’，目的片段大小为348bp。封闭野生型V617 V位点的LNA为5’－CAC AGA CAC ATA C－3’（图1）。当JAK2基因V617位点为野生型时，LNA可以与其结合，阻止PCR扩增，而当JAK2基因V617位点为突变型时，则LNA不能与其结合，PCR可以有效扩增。

图1 JAK2基因V617位点引物及LNA设计示意图

1.3.3 LNA PCR反应条件：PCR扩增反应条件为95℃3 min，然后95℃30s，60℃45s，72℃50s，共35个循环，最后72℃5 min。

1.3.4 LNA PCR检测JAK2基因V617F突变灵敏度分析：分别取经DNA测序确认的JAK2基因V617F突变型与JAK2基因V617 V未突变型基因组DNA，用去离子水将DNA浓度调整至2μg／ml，将JAK2基因V617F突变型与JAK2基因V617 V未突变型基因组DNA按1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶200依次进行混合，每一混合浓度分为加入LNA组和无LNA组，以JAK2基因V617 V未突变型基因组DNA（未加LNA）作为阳性对照，去离子水作为阴性对照，进行PCR扩增，扩增条件同前。PCR反应结束后，将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像并分析结果。

1.3.5 LNA PCR检测JAK2基因V617F突变的敏感性及特异性比较：将JAK2基因V617F突变型与JAK2基因V617 V未突变型基因组DNA（同1.3.4中的样品）按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10进行混合，一组加入LNA序列，另一组直接用JAK2基因PCR引物（不加入LNA序列）进行扩增，扩增条件同前。PCR反应结束后凝胶电泳，在紫外线下切胶回收后进行测序分析。

1.3.6 LNA PCR检测 MPD患者JAK2基因V617F突变：以人管家基因GAPDH为内参照，PCR分别扩增JAK2基因V617突变（加入引物和LNA）和GAPDH（加入引物）基因片段，其中GAPDH基因扩增上游引物为5’－ACC AAC TGC TTA GCA CCC CT－3’，下游引物为5’－TAC TCC TTG GAG GCC ATG TG－3’，扩增条件同前。反应结束后凝胶成像系统成像分析产物大小。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。检测数据采用百分比表示，线性结果采用拟合曲线。

2 结 果

2.1 LNA PCR检测JAK2基因V617F突变的灵敏度

LAN PCR检测结果显示，当JAK2基因V617F突变型与JAK2基因V617 V未突变型基因组混合比例达1∶100时，仍然可以检测出JAK2基因V617F突变型。PCR扩增产物凝胶电泳结果见图2。

2.2 LNA PCR检测JAK2基因V617F突变的敏感性及特异性

测序结果显示：加入LNA序列的一组除0∶10混合比例未检测到JAK2基因片段，其余均检测到JAK2基因V617F突变型纯合子，表明LNA PCR法特异性好。而未加入LNA序列的一组中，尽管都可以扩增出JAK2基因片段，且当JAK2基因V617F突变型占混合比例高于20%时，通过测序可以检测出JAK2基因V617F突变型（图3A～3D箭头所示），但当JAK2基因V617F突变型低于混合比例的20%时，通过测序法无法检测出JAK2基因V617F突变型的存在（图3E、3F）。

图2 PCR拉增产物电泳图

2.3 LNA PCR检测68例MPD患者JAK2基因的V617F突变

在68例MPD患者中，共检测出JAK2基因V617F突变患者55例，检出率80.88%。其中，在37例PV患者中，JAK2基因V617F突变比例为91.89%（34／37）；在22例 ET 患者中，JAK2基因V617F突变比例为68.18%（15／22）；在9例 MF患者中，JAK2基因V617F突变比例为66.67%（6／9）。

图3 JAK2基因V617突变位点测序图

3 讨 论

LNA［6］是一种人工合成的反义寡核苷酸，是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2’－O，4’－C－亚甲基－β－D－呋喃核糖核酸单体，其中核糖的2’－O位和4’－C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’－内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，因此其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，与DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性，不易被酶降解，可应用于PCR等技术中［7，8］。

本研究检测JAK2基因V617F突变所采用的LNA PCR方法与已报道的检测方法如限制性片段长度多态性分析［9］、高分辨溶解曲线［10］、等位基因特异性 PCR（AS－PCR）［11］、常规测序和实时定量PCR［12］等不同，其技术特点是通过LNA序列与JAK2基因V617野生型位点结合，从而阻滞PCR延伸，导致PCR扩增失败。但LNA序列不能与JAK2基因V617F突变位点结合，故其PCR扩增不受影响，因而能将突变型和野生型区分开来。本研究设计的LNA PCR检测JAK2基因V617F突变型非常特异，PCR产物经直接测序法验证均为JAK2基因V617F突变型纯合子。LNA PCR能从JAK2基因V617F突变型与JAK2基因V617 V未突变型混合比例为1∶100杂合子中检测出JAK2基因V617F突变型，其检测灵敏度达1%，而测序法灵敏度仅为20%。LNA PCR检测JAK2基因V617F突变型的灵敏度与AS－PCR法和高分辨溶解曲线法一致［10，11］，而明显高于限制性片段长度多态性分析法和常规测序法［9］，提示LNA PCR方法检测JAK2基因V617F突变型具有良好的临床应用价值。

本研究采用LNA PCR方法在68例MDP患者中共检测出JAK2基因V617F突变患者55例，在PV、ET和 MF患者中V617F突变率分别为91.89%、68.18%和66.67%，与相关研究［11，13］显示的JAK2基因V617F突变的阳性率在PV为80%～90%、ET为40%～70%和MF为35%～57%相一致。提示LNA PCR检测MPD患者JAK2基因V617F突变型方法可靠。

总之，本文建立的LNA PCR方法可有效检测JAK2基因V617F突变，具有灵敏度高、应用方便等特点。通过68例MPD临床标本的检测结果表明，本方案能有效提高突变检出率，有一定的临床应用价值。

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