内皮源性吲哚胺2，3－过氧化酶对自体移植静脉桥狭窄的抑制作用

肖永光 王贤灿

肖永光，王贤灿

武汉大学人民医院，武汉，430060

冠心病的外科治疗策略是利用血管桥重建心肌血供，静脉是目前较为常用的血管桥。但移植后静脉桥常因管壁增厚和管腔狭窄使临床远期疗效不佳［1］。造成这种结果的主要原因是血管壁中膜平滑肌细胞增生及其大量细胞外基质的堆积，因而如何抑制血管平滑肌细胞增生和减少细胞外基质生成成为缓解静脉桥狭窄的关键［2］。

吲哚胺2，3－过氧化酶（Indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶，其活性表达可引起细胞微环境中色氨酸分解代谢增强，从而抑制T细胞增殖。因此，它是一种潜在的免疫抑制酶，可以引起肿瘤的逃避和自体免疫耐受［3，4］。还有研究［5］发现内皮源性IDO可以在调节血流稳定方面起到一定作用。但IDO对移植静脉桥发生狭窄有无影响，目前尚无报道。本文探讨内皮源性IDO对移植静脉桥狭窄的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组

成年长耳大白兔32只（武汉大学医学院动物实验中心提供），体重2.0～2.5 Kg，雌雄不限。随机分为实验组和对照组，每组16只。实验组为内皮高表达IDO静脉桥组，对照组仅注射质粒载体，其余条件相同。

1.2 颈静脉桥的制备

先将含有人IDO 基因（human IDO，hIDO）的质粒（哈佛大学医学院附属儿童医院刘汉忠教授惠赠）导入大肠杆菌，然后将大肠杆菌置入500 ml含氯霉素的Terrific肉汤培养基（预加温至37℃），于37℃振摇培养（摇床转速300r／min）16h，最后收集并裂解细菌，分离和纯化质粒。在静脉桥移植前24h从实验组大白兔耳缘静脉注入质粒，即可获取血管内皮高表达IDO的颈静脉桥［6］。对照组质粒载体内不含IDO基因，其它培养条件同实验组静脉桥制备。

1.3 自体静脉桥移植

各组实验动物均用4%戊巴比妥钠（30 mg／Kg）耳缘静脉注射麻醉，并按1 mg／Kg剂量注入肝素抗凝。左颈部备皮，活力碘消毒。铺无菌单，以胸锁乳突肌中点为中心，作一2cm纵行皮肤切口。钝性分离皮下组织，显露左颈总动脉和颈外静脉。阻断颈外静脉近、远两端，剪取长约2cm血管桥，置于含肝素和罂粟碱的冰生理盐水中待用。颈外静脉两断端分别予以结扎。于颈总动脉近、远两端分别阻断，中间横断，在10倍手术显微镜下，用9－0医用无损伤线将动脉两端分别与静脉桥行端端吻合。吻合完毕，松开近端血管夹，排气，结扎缝线，最后松开远端血管夹。若吻合口渗血，用棉签压迫止血。吻合完毕见静脉桥明显扩张、触之可及震颤，表示静脉桥通畅。术毕依层缝合，关闭切口。置动物于室温，麻醉自然清醒。术毕每日触摸颈部，静脉桥处可及震颤。两组动物均成功制备和移植自体静脉桥。

1.4 标本采集和处理

术后两组动物常规饲养，手术当天及术后第7、14及21天随机抽取两组动物各4只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切开，游离静脉桥，清除静脉壁外附着组织，阻断两端吻合处，向腔内注入适量10%甲醛液，10 min后切取移植静脉桥进行常规病理切片，HE染色及PCNA免疫组化染色。实验动物均放血处死。

1.5 观察指标

（1）HE染色后，以内弹力膜为界，用IPP计算机图像分析系统测量移植静脉桥中膜平均厚度。（2）计算静脉桥中膜平滑肌细胞核PCNA染色阳性指数（PCNA指数为镜下100个细胞中PCNA阳性细胞所占的百分率）。PCNA阳性细胞胞核呈棕色或深棕色。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 两组中膜厚度比较（n均＝4）

2 结 果

两组移植静脉桥均有不同程度增厚，且有随移植时间延长而增加的趋势。移植后第21天，实验组静脉桥中膜厚度测值（62.50±3.40μm）明显低于对照组（112.30±7.80μm）（P＜0.05，图1）。

但在术后静脉桥持续增厚时，两组中膜平滑肌细胞PCNA阳性指数由上升（术后第14天）转为下降趋势，术后第21天，实验组PCNA阳性指数（14.00%±3.40%）明显低于对照组（22.30%±5.40%），差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 两组PCNA阳性指数比较（n均＝4）

3 讨 论

研究［7］表明，静脉桥发生狭窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌样细胞增生并分泌大量细胞外基质在血管壁内堆积，从而形成移植桥血管管腔狭窄，导致闭塞。内皮源性IDO通过消耗血管壁中膜平滑肌细胞内的三磷酸腺苷（ATP），造成这些细胞内能源耗竭，使高尔基复合体内的能量利用减少，从而减少蛋白合成，抑制细胞增殖的发生［8］。

本文结果显示，在静脉桥移植后两组静脉桥均有不同程度地增厚，移植后第21天实验组静脉桥中膜厚度明显低于对照组，PCNA阳性指数明显下降，表明内皮源性IDO能够有效缓解静脉桥狭窄的发生。

本实验结果还显示静脉桥在术后呈持续增厚时，平滑肌细胞的PCNA阳性指数从术后第14天开始呈下降趋势，且在实验组和对照组均出现上述现象，提示此时导致内膜增厚的主要原因并非血管平滑肌细胞的增殖，而可能是由细胞外基质堆积所致。另外观察到，两组静脉桥内膜和外膜PCNA阳性细胞较少，其厚度变化不明显，可见桥静脉管腔狭窄的主要原因是血管中膜增厚［9］。

综上所述，内皮源性IDO能够有效缓解静脉桥狭窄的发生，其对较晚期静脉桥的狭窄除抑制平滑肌细胞增殖外，还可抑制蛋白质合成，减少细胞外基质的堆积，从而起到缓解静脉狭窄的作用。

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4 Liu H，Liu L，Visner GA.Nonviral gene delivery with indoleamine 2，3－dioxygenase targeting pul monary endothelium protects against ischemia－reperf usion injury［J］. American Journal of Transplantation，2007，135，7（10）：2 291～2 300.

5 Liu H，Visner GA.Applications of sleeping beauty transposons for nonviral gene therapy［J］.IUBMB Life，2007，59（6）：374～379.

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