CX37基因1019C/T多态性与腰椎间盘突出症及临床分型的关系

陈 思，陈剑峰，程 力，3*

(1.南京医科大学，南京210046;2.无锡市中医医院，江苏 无锡214000;3.无锡市人民医院，江苏无锡214000)

间隙性连接蛋白37(connexins37，CX37)的作用是在细胞膜上形成间隙连接通道供细胞间直接信息交流，它的异常与炎性介导的疾病相关。研究发现，CX37基因多态性与动脉粥样硬化、心血管病密切相关［1］，而中枢神经系统也有 CX37 的表达［2］。对于CX37在椎间盘组织的分布及腰椎间盘突出症发病的潜在影响，相关研究并不多。因此，本文拟初步探讨CX37基因多态性与腰椎间盘突出症的关系，筛选腰椎间盘突出症的易感基因，为其临床预防提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选择2013年12月—2014年4月在我院脊柱脊髓科住院的腰椎间盘突出症患者191例，均符合国际腰椎研究会(ISSLS)的诊断标准。根据影像学表现分为膨出型64例，突出型98例，脱出型29例，其中男96例，女95例，年龄36～78岁，平均年龄54.4岁;对照组187例，男92例，女95例，年龄41～70岁，平均年龄52.7岁。腰椎间盘突出症临床分型包括膨出型、突出型、脱出型(后纵韧带下和后纵韧带后)以及游离型，此研究将游离型一并纳入脱出型。同期选择健康人群187例作为对照组。

1.2 基因型判定

1.2.1 标本采集及DNA的抽取 所有患者均取清晨空腹外周血5 mL，加入有EDTA-Na2的抗凝管中，摇匀，提取基因组DNA，-20℃冰箱保存待用。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)扩增已提取的基因组DNA:Connexin37 C1019T位点引物序列如下。正义:5＇-CCTCCTCAGACCCTTACACGG-3＇，反义:5＇-CATCCCAGGCAGCCAGACT-3＇。20 μL PCR 反应体系中 含:10 μL 2 ×mix，1.0 μL 正义引物(10 pmol)，1.0 μL 反义引物(10 pmol)，2 μL 模板 DNA(如果浓度过低，调整为4.0 μL)，6 μLddH2O。PCR 反应条件为:94 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72℃最后延伸7 min，然后在-4℃保存。

1.2.3 基因测序 PCR产物取5 μL于2%琼脂糖凝胶，180 V电压电泳10 min，然后经过凝胶成像系统分析。

1.3 统计学分析 统计分析均由SPSS 13.0软件包完成。基因型和等位基因频率通过基因计数法计算。χ2检验判断基因型的 Hardy-Weinberg平衡符合程度，组间基因型和等位基因频率比较用四格表χ2检验和R×C例联表χ2检验，组间数据比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CX37基因1019C/T的基因型 分析结果表明，CX37基因位点1019C/T多态性分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。根据基因测序结果，2组人群CX37基因型都出现3种，分别为CC型、TT型及TC型。

2.2 对照组与膨出型组CX37基因型、等位基因频率分布比较 CX37基因型(CC型，CT型、TT型)在对照组和膨出型组中分布频率无统计学意义(P＞0.05)。C、T等位基因频率在上述2组中的对比亦无显著统计学意义(P＞0.05)。同时在2组的性别亚分组中间也未发现有统计学意义。

2.3 对照组与突出组CX37基因型、等位基因频率分布比较 CX37基因型(CC型，CT型，TT型)在突出型组中分布频率分别为48.0%，32.6%，19.4%优于对照组中的16.6%，34.2%，49.2%(P＜0.05)。突出型组的C等位基因(CC+CT)频率(60.8%)显著高于对照组(37.8%)，P＜0.05。在性别亚分组分析比较中，男性人群的CC基因型和C等位基因频率在突出型组中明显高于对照组(P＜0.05)，而在女性中突出型组与对照组比较无统计学意义，见表1。

2.4 对照组与脱出组CX37基因型、等位基因频率分布比较 CX37基因型(CC型，CT型、TT型)在脱出型组中分布频率分别为58.6%，27.6%，13.8%优于对照组中的16.6%，34.2%，49.2%(P＜0.05)。突出型组的C等位基因(CC+CT)频率(67.6%)显著高于对照组(37.8%)，P＜0.05。在性别亚分组分析比较中，男性人群的CC基因型和C等位基因频率在突出型组中明显高于对照组(P＜0.05)，而在女性中突出型组与对照组比较无统计学意义，见表2。

表1 对照组与突出型组CX37基因型、等位基因频率分布 例(%)

表2 对照组与脱出型组CX37基因型、等位基因频率分布 例(%)

3 讨论

腰椎间盘突出症是骨科临床常见病和多发病。造成腰椎间盘突出症的病因复杂，包括生物力学异常、外伤、自身免疫改变、遗传因素等［3-4］。然而，治疗的最优化并未带来疗效的最佳化［5］。究其原因，腰椎间盘退变或突出后引起疼痛的机制尚不清楚。传统观点认为的机械性压迫学说并不能满意地解释所有临床和病理现象。研究提示，椎间盘突出附近的神经根常有充血、水肿、炎症变化。国内外大量学者研究认为突出的髓核物质中所含的内源性化学炎症介质会引起炎症，产生疼痛［6］。而突出后的髓核组织还会有新生的血管增生和巨噬细胞的浸润，突出髓核局部的炎症物质聚集与疼痛症状的产生密切相关［7-8］。最近，基于基因学的研究开始得到广泛关注，其中Cx蛋白家族与许多相关疾病的联系成为热点。

Cx蛋白家族广泛存在于脊柱动物，并组成细胞间的通讯结构。Cx基因在人类可能有21种，这种通讯方式与机体多种疾病密切相关，因此成为近年来研究的热点。不同的氨基酸序列造成Cx有着各不相同的功能。研究发现Cx32在肝脏、胃、宫颈等组织中的表达，与癌症的发病有着密切的联系［9］;而神经系统中，Cx36是Cx家族中目前唯一被证明构成哺乳动物脑神经元之间间隙连接的蛋白。心血管系统中的Cx主要是 Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，Cx46，并且分布在心脏的不同区域，在调节心脏传导速度方面起着重要的作用［10-11］。其中，Cx37基因C1019T多态性直接影响了间隙连接蛋白三级结构的形成，进而影响蛋白质的合成、转运、加工以及信号转导过程［12］，并常存在于脉管系统(如内皮细胞、平滑肌细胞)和炎症细胞中(如单核细胞、巨噬细胞)。目前研究大多集中在其与心血管疾病发生发展的关联，而对CX37基因C1019T多态性与椎间盘突出症发病的研究鲜有报道。本研究采用病例—对照研究方法，显示了Cx37基因C1019T多态性不仅跟腰椎间盘突出症的发生有关，而且在各型(膨出型、突出型和脱出型)之间以及性别上也存在着差异。腰椎间盘突出症的发生与Cx37的CC基因型和C等位基因频率(CC+CT)增高有关，但在膨出型患者中未见明显统计学意义，其与患者突出症状不严重，纤维环并未有破裂有关，提示CC基因型和C等位基因频率(CC+CT)增高可能与突出的髓核物质中所含的内源性化学炎症介质有关。男女组间的比较，提示男女间腰椎间盘突出症的发生存在遗传学机制上的差异，男性表现明显，同时也为该基因研究在腰椎间盘突出症群体中(尤其男性)筛查高危人群提供了可能依据。

研究结果体现出了Connexin37基因C1019T多态性与腰椎间盘突出症之间的关联性，但由于本研究中各组样本例数偏少，同时腰椎间盘突出症本身也是一种多因素的疾病，单一致病因素可能在疾病的发生发展中影响较小，Connexin37基因C1019T多态性与腰椎间盘突出症之间的确切关系尚有待于大样本的进一步研究。

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