脑缺血性中风抗血栓治疗的研究进展

熊亚楠

(连云港中医药高等职业技术学校，江苏连云港 222007)

中风是由于脑部供血受阻而迅速发展为脑功能损伤的疾病，可分为缺血性中风和出血性中风。大约80%的中风是由动脉闭塞引发的脑缺血造成的，即缺血性中风;超过20%是由颅内出血引起的，即出血性中风。中风已成为世界第二大致死原因。缺血性中风治疗目的在于清除血栓，恢复缺血脑组织的供血，但同时又避免脑出血现象的发生。由于缺血性脑中风的病理生理机制极为复杂，因此不同机制采取需不同的治疗方法，主要包括超早期溶栓治疗，急性期抗栓治疗，以及神经保护药物使用等。目前对于引发和维系脑血栓形成的分子途径仍然存在很多未知，常用的血小板抑制剂如乙酰水杨酸(ASA)和抗凝剂如低分子量肝素、重组组织纤溶酶原激活剂(tPA)，因治疗时间窗要求较短，且可增加出血危险，所以其临床应用一直受到一定的限制。中风的治疗仍然需要更有效更安全的抗血栓药物［1］，其中血小板和凝结因子作为首要的靶点得到越来越多的关注。本文综述了在中风小鼠模型实验中有关血小板和凝结物新的病理生理学观点，这些基础研究将激发“无出血抗血栓”的概念，期待这将在未来的临床试验中得到实现。

1 血栓形成的基本机制

在正常的生理状态下，人体内有着复杂精细的调节机制，因此血栓不会轻易形成。当血管受损后，暴露的内膜组织可以激活血小板和血浆中的凝血系统，由纤维蛋白和血小板共同组成止血栓子，有效止血。正常的血管内皮细胞具有抗栓特性，它通过表面负电荷，释放各种物质，防止血小板黏附、聚集，促进纤维蛋白溶解、抑制血液凝固过程，使体内血液保持液体状态及血管畅通起着重要的作用，防止血栓形成。这个调节机制依赖于人体内促凝血物质和抗凝血物质的动态平衡。

当人体处于疾病状态时，人体的凝血和溶栓机能失常，导致促凝血物质和抗凝血物质的动态平衡遭到破坏，其原因包括血管内皮细胞损伤、血流状态改变、血液凝固性增高等。当内皮细胞受到机械、感染、免疫、化学物和代谢产物等损伤时，内皮细胞脱落而导致内皮下组织暴露，或各种先天性疾病中的内皮细胞功能缺陷时，血管壁抗栓作用减弱，同时，血管壁中存在的潜在促血栓形成机制产生了有利血栓形成的变化，如vWF、组织因子(TF)等。因此，血管内容易形成血栓凝块，堵塞血管，甚至危及人类生命健康。血栓如果形成在脑动脉血管中，将会导致脑血栓和缺血性中风。

2 血小板为靶点的治疗

血栓形成是一个受到多因素调节的复杂过程，其中血小板在破损血管壁处的初始粘附、血小板的稳定粘附、以及血小板聚集等是止血的必要步骤也是导致闭塞性血管病变关键环节［3］。在血管损伤处，内皮细胞外基质(subendothelial extracellular matrix，ECM)暴露在血流中，激发血小板附着并活化血小板(初级止血)，然后激发凝血系统(二级止血)，初级和二级止血协同形成富含纤维蛋白的血栓来堵住伤口，启动伤口愈合。ECM中包含多种黏性大分子，如层黏连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白。血小板能够通过特异性受体连接到这些大分子上，这些特异性受体在止血级联反应中有不同的作用［4］。血小板在损伤处附着的机制很大程度上决定于血液流变条件。流动的血液相邻的层产生剪切力，其中血管壁上的力最大，阻碍血小板的黏附和聚集。在动脉血管中高剪切力条件下，血小板开始被束缚到损伤血管壁的内皮细胞基质上，完全依赖血小板受体糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib和血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的相互作用。GPIbvWF结合并不产生稳定的血小板黏附而是降低血小板的流动速度从而使得它们与高度致血栓胶原蛋白相互作用［5］，这一过程由免疫球蛋白超家族受体GPVI介导。GPVI是有效的信号-能量转换受体，只在血小板及其前体巨核细胞中表达。GPVI连接介导血小板完全活化，胞内钙离子浓度增加［6］。细胞内外信号的相互作用上调了整合蛋白受体的功能，主要是GPIIb/IIIa通过血浆纤维蛋白的连接形成稳定的血小板-ECM的连接和血小板聚集，以进一步稳定血栓。脑缺血性中风中血栓形成机制也大致相同［7］。

血小板在动脉血栓和心血管疾病的发展中起到了非常重要的作用。没有哪个单细胞像血小板这样引起疾病的高发病率和高死亡率。通过封闭血小板粘附和聚集的相关分子通路，来抑制血栓的形成。因此，它也是抗血栓治疗的主要治疗靶点，为治疗脑缺血性中风提供新思路。

2.1 封闭 GPIb-VWF轴 在血流高剪切力条件下GPIb-vWF对于血小板的黏附起到重要作用，因此GPIb-vWF发展成为新的抗血栓因子。在最近几十年内，通过各种实验动脉血栓模型验证了GPIbvWF抑制剂抗血栓的功效［8］。然而，GPIb-vWF对脑局部缺血的作用机制仍然不清楚，在最近的研究表明GPIb-vWF与中风的发展是相关的。蛋白 Ibα(GPIbα)是 vWF的血小板表面受体，通过蛋白间的相互作用血小板可以黏附在受损的血管壁上并进一步聚集，最终导致血栓的形成。

首先，Kleinschnitz等实验显示小鼠用抗GPIbα药物在大脑中动脉闭塞(tMCAO)小鼠模型上急剧降低了中风的梗死面积和大脑功能缺陷［9］。研究表明GPIb在脑缺血或再灌注损伤中动脉血栓的形成起到重要作用［10］，GPIb与VWF连接对于血小板粘附是必须的。vWF是巨核细胞和内皮细胞产生的多聚糖蛋白。缺乏vWF导致了常见的出血性疾病血性管血友病［11］。为了更深入的了解vWF不同区域的作用，De Meyer等转入不同的vWF突变基因到vWF缺陷小鼠中。这项实验显示vWF连接胶原蛋白和GPIba，而不是GIIb/IIIa，这是中风发展的必要步骤，抑制vWF与胶原的连接是预防血栓的药理学靶点［5］。这些结果显示 GPIb-vWF轴对于脑缺血/再灌注病理性血栓的形成至关重要。Momi S等在guinea猪实验中风模型上用纳米抗体ALX-0081针对vWF的A1结构域，阻止vWF结合GPIb，有效的溶解颅内新的血栓形成并减少脑梗死体积，并且没有引起颅内出血［12－13］。

有研究显示其他机制如提高vWF的活性同样增加中风的危险。vWF的活性是由去整合素样酶、金属蛋白酶和血小板反应素13(ADAMTS13)共同调节的。vWF的活性与多聚体的体积有关，巨形vWF多聚体甚至可以自发形成微血栓。为了防止自发性血栓的形成，巨形的vWF往往被ADAMTS13裂解为小的低活性的分子。缺乏ADAMTS13活性导致血栓性血小板减少性紫癜，包括脑在内的许多器官中微血栓闭塞血管［14］。Fujioka等发现 ADAMTS13缺陷小鼠比野生型小鼠患中风几率大大提高［15］，进一步证实vWF在中风后脑血管血栓形成中起到重要作用。相反，将野生型小鼠给予ADAMTS13处理，梗死灶变小，并无致敏性脑出血［16］。这显示抑制GPIb-VWF相互作用，同时裂解VWF本身可能将成为中风治疗的新策略。

2.2 封闭GPVI 血小板GPVI对于将血小板稳定地粘附于裸露的胶原蛋白上至关重要，它能引发强烈信号使血小板活化。GPVI是来自免疫球蛋白超家族的I型受体并且只在血小板上表达［17］。在体内和体外实验中用特异性抗体封闭GPVI能非常有效的防止血栓的形成。Al-Tamimi M等发现在急性脑缺血病人中，血浆中可溶性GPVI水平显著提高，这显示了激活GPVI在中风发病有潜在的作用［18］，可溶性GPVI有望成为诊断缺血性中风的新的标志物［19］。Kleinschnitz C等为了研究 GPVI是否对中风损伤起作用，用抗-GPVI抗体在tMCAO小鼠模型上进行实验。在tMCAO小鼠模型上60 min后给药，抑制 GPVI在一天内显著降低了梗死的体积［19］。这种治疗过程是安全的，并没有增加出血并发症。Goebel S等用特异性连接GPVI胞外区域的Fc融合蛋白——Revacept在实验性中风小鼠模型中同样能减少动脉血栓形成，减小梗死面积和防治缺血性中风后引发的脑水肿，提高神经功能并且无颅内出血。Revacept可以同时阻止GPVI和vWF介导的血小板粘附和聚集，因此有望成为治疗缺血性中风及其并发症的强有力的工具［20］。

2.3 抑制GIIb/IIIa通路 GIIb/IIIa通路对介导血小板不可逆聚集和随后血栓增长至关重要。因此，药物抑制这个血小板活化通路已经成为备受青睐的抗血栓策略［21］。抑制 GIIb/IIIa并不能改善tMCAO小鼠模型中风面积的大小或是提高神经功能，治疗结果反而导致颅内出血和死亡率的大幅增加。为了更好的疗效，通过GPIbα或GPVI的抑制剂来阻止血小板的早期附着，这样的结果乍看起来似乎有悖常理。然而，GPIbα能够连接vWF以外的分子，如血管内皮细胞上的P-选择素和白细胞上的Mac-1。因此，Stoll G等认为抑制GPIbα比抑制GIIb/IIIa更加积极的影响微血管功能障碍的若干机制，如血栓和炎症，从而提供更广阔的神经元损伤保护［22］。早期研究表明在实验中风模型中不同的GIIb/IIIa受体拮抗剂提高了神经功能修复，但是却伴随着剂量依赖性颅内出血的增加。Adams HP等证实GIIb/IIIa受体拮抗剂阿昔单抗(Abciximab)在治疗急性缺血性中风三期临床试验中同样有出血问题［23］。这项研究过早的停止是因为出血并发症显著增加并且治疗组缺乏有效的疗效。替罗非班(Tirofiban)在治疗急性缺血性中风时，能降低6个月的死亡率，但是在改善神经功能和致残率上没有效果［24］。Torgano G等研究在中风后6 h替罗非班和阿司匹林的疗效对比，未发现替罗非班在短期神经功能提升和长期致残率降低方面比阿司匹林更好［25］。基于临床的有限应用，众多制药发展计划停止，GIIb/IIIa受体拮抗剂在中风的分子通路有待更深入的研究，并且其药理学效果还需有所改善。GIIb/IIIa通路对于血栓形成还是非常重要的环节，希望未来可以找到配体整合酶抑制剂设计的固有问题，研发出新型GIIb/IIIa抑制剂。

3 凝血级联系统作为靶点的治疗

活化的血小板通过两条途径来激活凝血级联系统。首先，通过带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)为凝血因子提供高亲和位点，从而产生FXa和凝血酶。其次，活化的血小板释放出带负电的无机聚磷酸盐(PolyP)以激活FIX，这是激活内源性凝血系统的起点［26］。凝血级联系统由几个连续相连的丝氨酸蛋白酶组成。激活的凝血级联系统导致凝血并最终生成纤维蛋白，从而稳固了血小板血栓块。

早期实验抑制特定的凝血系统构成要素，如FIXa和FXa，得到了有前景的新发现。在大鼠血栓栓塞中风模型中，抑制FXa减小血栓的体积并提升神经效能而没有出血的风险。同样，抑制FIX有同样的效果。低剂量FIX抑制剂在缺血性中风中起保护作用，却不会引起颅内出血，而高剂量则会引起脑出血，与肝素和tPA相似。还需要大量的研究来确立这些凝血系统中重要组分在治疗中风中的安全性和有效性［27］。

近些年，另一个因子FXIIa作为防止血栓形成的候选者正引起人们的兴趣。FXII一直被认为与血栓形成无关，即使在血管损伤时FXII缺乏与出血因素也没有关联。然而，这个观点在近几年有所改变。FXII缺陷小鼠显示在动脉血管壁损伤不会形成稳定血栓块，但是也不会增加出血率［28］。缺乏FXIIa在实验性中风中同样会发生有趣的现象:患有tMCAO的FXII－/－小鼠与同样患病的野生小鼠对比栓塞体积明显减小，约为50%，并且严重的神经损伤减少。在中风后组织学分析显示脑毛细血管中微血管血栓明显减少。同样FXI－/－小鼠患tMCAO后可以避免了脑血管闭塞引发的血栓形成和中风，进一步显示在中风中内源性凝血通路对病理性血凝块具有一定的作用［29］。从安全的角度看，缺乏FXII活性不会发生颅内出血。

从转基因小鼠模型中得到的结果，从机制角度看是激动人心的，但这并不代表临床的疗效。如果想治疗病人，有效的药理抑制剂是必须的。FXIIa的选择性抑制剂是rHA-Infestin-4的重组蛋白，为Kazal型丝氨酸蛋白抑制剂，最初从Triatoma infestans吸血昆虫的肠道中分离出来的。与FXII－/－小鼠表现出来的抗血栓表型相同，这种物质在不同的大鼠和小鼠血栓模型几乎完全阻止血栓形成，而没有延长尾部出血时间［30］。另外，用 rHA-Infestin-4预处理小鼠在tMCAO之后显著降低中风面积和减少神经功能性缺陷［30］。关于rHA-Infestin-4的新研究正在进一步的测试中，以确定它在中风模型中对血栓栓塞的效果。rHA-Infestin-4同样会抑制FXIIa的活性。尽管FXII有很好的临床前数据，但是在人体中风的病理生理上的具体作用还未确定，需要进一步深入的临床试验数据。

4 结语

综上所述，理想的抗血栓药物除有良好的疗效外，需不增加出血的风险尤其在大脑，微小的颅内出血能引发非常严重的后果。通过GPIb-vWF-GPVI通路来介导血小板的附着和激活并且后续FXII的活化构成了急性脑缺血中风的重要病理机制。相应的药物也先后进入临床前后期研究临床研究，包括rHA-Infestin-4、抑制GPIb-VWF通路的适体、人源化抗-VWF抗体和GPVI的融合蛋白Revacept等，通过进一步的实验来确定其安全性和有效性，它们是脑缺血性中风抗血栓治疗的研究热点。相信通过研究人员的不懈努力，“无出血抗血栓”在缺血性脑中风的治疗中必将会实现。

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