基于计算机辅助药物设计的石荠 抗流感药效物质多靶向作用研究

邓丽丽 ，臧家娜 ，余陈欢 ，俞 冰

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053； 2.浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013）

计算机辅助药物设计（CADD）应用量子力学、分子动力学、构效关系等基础理论数据，研究药物对酶、受体等作用的药效模型，从而达到药物设计的目的，是实现合理药物设计的基本手段和工具。目前，该技术已渗透并介入到药物发现、设计、开发等各个阶段，通过对药物先导化合物结构的优化及新的作用蛋白靶点的模型构建，简化了药物研究的前期过程，从而比以往的高通量筛选技术，显现出了独特的优越性[1]。随着近年来生物信息学技术和化学信息技术的不断革新，新的作用蛋白靶点不断被研究、发现和构效解析，为CADD的研究提供了广阔的发展空间，同时也为中药及其复方药效物质基础的研究提供了强大的工具，为中药及其复方药效物质基础和分子机制的研究带来新的机遇。石荠Mosla scabra为唇形科草本植物，具有清热解毒、理气化湿的功效，《浙江民间常用草药》记载其主治夏日感冒、腹痛泄泻、跌打损伤等[2]。本课题组在前期研究中发现，石荠 （MDE）具抗炎、抗流感病毒作用[3-4]。本试验中，在MDE药效机制及化学成分分析[5-6]的基础上，采用分子力学和柔性分子对接相结合的方法，以5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮及其衍生物为候选药物，研究其与流感血凝素蛋白（HA）、流感神经氨酸酶（NA）、炎症靶点环氧合酶 2（COX-2）和炎症靶点磷酸二酯酶 4（PDE4）受体的相互作用，在此基础上阐明MDE抗流感病毒的作用机制，为从植物天然产物中筛选流感药物先导化合物指明方向，也为有针对性地修饰现有的流感药物提供理论依据。

1 试验工具与方法

1.1 试验工具

本研究的蛋白靶点均从Protein Data Bank（PDB）数据库中获取。5-羟基-6，7-二甲氧基黄酮及其衍生物均由 Chem Bio 3D Ultra 12.0（美国剑桥公司）构建。采用 Sybyl-X1.1软件（美国Tripos公司）中的 Surflex-dock模块和 DS 2.5软件（美国 Accelrys公司）中的 Pharmacophore Generation模块进行。采用 iGEMDOCK软件（台湾国立Chiao Tung大学）进行分子力学分析。所有计算均在Windows XP操作系统上完成。

1.2 试验方法

1.2.1 石荠 黄酮类成分数据库的建立

结合中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库的子数据库“中药与有效成分数据库”以及PubMed数据库的子数据库“Pub Chem compound”，通过 Chem Bio 3D Ultra 12.0 软件，将其在MMFF94力场下进行结构优化，并保存为SDF格式。候选药物化学结构见图1。

图1 候选药物化学结构

1.2.2 针对各靶点的分子对接

HA：HA的晶体结构引自 PDB数据库，分辨率为 2.50Å（PDB ID：2HTY）。保留晶体结构内活性腔附近Ca2+和2个结合水分子，删除其他杂原子，然后用Biopolymer模块修正蛋白质晶体结构的化学键、添加氢原子（pH＝7）和末端氨基酸残基的修饰。因为抑制剂和血凝素蛋白的作用是发生在水溶液中，故采用半径为8Å的TIP3P水模型，将血凝素蛋白结构置于其中。

NA：NA的晶体结构引自PDB数据库，分辨率为2.49Å（PDB ID：309K）。保留结晶水，对照 NA-乙酰葡萄酰胺（NAG）复合物晶体结构(PDB ID：1F8B)补齐缺失残基，并加入氢原子及其他遗漏原子，能量优化后构型作为对接起始结构。将蛋白进行预处理，删除水分子，去掉除NAG以外的所有配体残基；以NAG为中心生成格点，并在受体8Å范围内进行对接。

COX-2：COX-2的晶体结构引自 PDB数据库，分辨率为2.90 Å（PDB ID：4COX）。因 COX-2 为同源二聚体，在参考其活性口袋[7]的基础上，选取其A链(即二聚体中的第1个单位)，去除配体，加氢，作为分子对接的“受体”。计算过程中仅考虑配体分子8Å范围内的氨基酸残基与配体的相互作用。首先固定受体COX-2的几何构型，优化配体分子，然后对配体分子8Å范围内的氨基酸不作任何限制，将配体和受体进行分子对接。

PDE4：PDE4的晶体结构引自PDB数据库，为PDE-4B2B与抑制剂 NPV 的复合物，分辨率为 1.95Å（PDB ID：2QYL）。将蛋白进行预处理，删除水分子，去掉除NPV以外的所有配体残基；以NPV为中心生成格点，并在受体8Å范围内进行对接。

1.2.3 分子对接结果分析

通过iGEMDOCK模块测得MDE黄酮类化合物与各蛋白受体关键氨基酸残基间的范德华作用能、静电作用能、氢键能等数据，以软件综合评分（匹配度）为指标进行对接效果评价。其他设置均采用默认值。采用DS 2.5软件对候选药物与作用蛋白受体活性位点进行结构分析。

2 结果

2.1 以HA为靶点的分子对接结果

采用iGEMDOCK软件对候选药物与HA活性位点进行分子对接，结果按打分高低排序，经统计分析，匹配度打分小于-5（门槛值）的候选药物共有6个（表1），打分高低排序靠前的5个化学成分分子分别为木犀草素＞槲皮素＞黄芩素＞汉黄芩素＞花椒油素，其中以木犀草素与HA活性位点的匹配度最高，证明MDE中所含的黄酮类化合物为天然HA抑制剂。这与Liu等[8]报道的结果一致。同时，由表1可知，各药物作用能和总能量等数据基本相似，以木犀草素为例，其范德华作用能为-43.26 kcal/mol，氢键能为 -26.98 kcal/mol，表明木犀草素等优势候选药物与血凝素蛋白之间的主要作用是范德华力。

2.2 以NA为靶点的分子对接结果

采用iGEMDOCK软件对候选药物与NA活性位点进行分子对接，结果按打分高低排序，经统计分析，各候选药物的匹配度分值均小于-5（表1）。打分高低排序靠前的5个化学成分分子分别为鼠李柠檬素＞槲皮素＞黄芩素＞桑色素＞MF2，其中以鼠李柠檬素与NA活性位点的匹配度最高，证明MDE中所含的黄酮类化合物为天然NA抑制剂。这与王海娣等[9]报道的结果一致。同时，由表1可知，各药物作用能和总能量等数据基本相似，以鼠李柠檬素为例，其范德华作用能为-64.18 kcal/mol，氢键能为-30.79 kcal/mol，表明鼠李柠檬素等优势候选药物与 NA之间的主要作用是范德华力。

2.3 以COX-2为靶点的分子对接结果

采用iGEMDOCK软件对候选药物与COX-2活性位点进行分子对接，结果按打分高低排序，经统计分析，各候选药物的匹配度打分均远小于-5（表2）。打分高低排序靠前的5个化学成分分子分别为槲皮素＞MF2＞木犀草素＞桑色素＞金合欢素，其中以槲皮素与COX-2活性位点的匹配度最高，证明MDE中所含的黄酮类化合物均为天然COX-2抑制剂。同时，由表2可知，各药物作用能和总能量等数据基本相似，以槲皮素为例，其范德华作用能为 -53.25 kcal/mol，氢键能为 -25.10 kcal/mol，表明槲皮素等候选药物与COX-2之间的主要作用是范德华力。

2.4 以PDE4为靶点的分子对接结果

采用iGEMDOCK软件对候选药物与PDE4活性位点进行分子对接，结果按打分高低排序。由于PDE4的活性口袋并非封闭性结合腔，对接分子与结合腔残基的碰撞情况较少，故整体的对接打分区分度不大，但对接结果较好的分子仍应视为可能具有PDE4抑制活性的化合物。经统计分析，各候选药物的匹配度打分均远远小于 -5（表2）。打分高低排序靠前的5个化学成分分子分别为鼠李柠檬素＞黄芩素＞槲皮素＞山柰酚＞金合欢素，其中以鼠李柠檬素与PDE4活性位点的匹配度最高，证明MDE中所含的黄酮类化合物均为天然PDE4抑制剂。同时，由表2可知，各药物作用能和总能量等数据基本相似，以鼠李柠檬素为例，其范德华作用能为 -90.29 kcal/mol，静电作用能为 -17.96 kcal/mol，氢键能为 -11.98 kcal/mol，表明鼠李柠檬素等优势候选药物与PDE4之间的主要作用是范德华力。

2.5 石荠 黄酮类成分抗流感作用的综合评价

以HA，NA，COX-2和PDE4分子对接打分排序前20%的分子作为可能具有 HA，NA，COX-2和 PDE4生物抑制活性的分子，分析MDE中MF1及其衍生物的多靶导向作用。由表1及表2可知，共有7个化合物（黄芩素、鼠李柠檬素、槲皮素、木犀草素、金合欢素、桑色素和MF2）可同时抑制2个及以上靶标蛋白，其中槲皮素对4个靶标均呈较强的抑制作用，提示这些化合物可作为潜在的抗病毒、抗炎先导化合物。而MF1，MF2和MF3也均表现出不同程度的抗流感病毒和抗炎作用，证明这三者是MDE发挥抗流感病毒和抗炎作用的药效物质。

3 讨论

CADD是近年来发展起来的研究与开发新药的一种崭新技术，以量子化学、分子力学和分子动力学等为理论依据，借助计算机数值计算和逻辑判断、数据库、图形学、人工智能等处理技术，进行合理的药物设计。CADD的出现大大加快了研制新药的速度，节省了新药开发工作的人力、物力和财力，因为它从理论的角度出发，可避免以前研究中一定程度的盲目性，能进行直观地设计，指导有目的地开发新药[10]。以美国 Structure Bioinformatics Inc.(SBI)提供的数据为例，平均每个新靶点需筛选10万个化合物，其命中率为0.1% ～0.01%，而以CADD进行新药设计，其命中率可提高到 5%～20%，可减少 99.9%的费用。目前应用CADD成功设计出的新型药物已有大量报道，如由Merck Sharp and Dohme公司开发的用于治疗青光眼的碳酸酐酶抑制剂多佐拉米（Dorzolamid）、由Roche公司开发的 HIV蛋白酶抑制剂类抗艾滋病药物沙奎那韦（saquinavir）等，而设计成功已进入临床研究阶段的药物更多。世界上许多规模较大的制药公司，近20年来纷纷投入巨资建立计算机理论和应用研究部门，以带动新药开发。

表1 候选药物与HA及NA的分子对接结果

表2 候选药物与COX-2及PDE4的分子对接结果

中草药治疗流行性感冒有数千年的历史，不少方药具有独特的疗效，并通过多靶点、多途径发挥作用[11-12]。这种多靶向作用一方面表现在多成分的多靶向作用，另一方面也可能存在单个分子的多靶向作用，而正是由于这种多靶向“霹弹”作用的原理，弥补了中药复方针对单靶药效不强的缺陷，表现出整体治疗、治调并举的特色。如何用现代语言阐释这种整体治疗的原理与特色，到目前为止还是中医药研究领域的难点之一。中草药在防治流感病毒方面具有独特的优势和广阔的应用前景[13]，但中药及其复方常含有数百种化学成分，其真正的药效物质基础目前还知之甚少，其防治疾病的分子机制也尚未明确。因此，有必要对中药及其复方药效物质基础和分子机制进行深入研究，并作出科学诠释。

本试验中通过CADD技术，综合应用分子对接、药效团模型及虚拟筛选方法，以抗流感病毒和抗炎作用为研究对象，对多靶点治疗的药效学作出阐释。选取目前已明确的流感病毒蛋白靶标（HA和 NA）及炎症靶标（COX-2和 PDE4），对化学成分分子库进行虚拟筛选，并在此基础上进行综合分析。由表1及表2可知，MDE中化学成分对流感病毒蛋白靶点和炎症相关蛋白靶点均具有一定的结合和抑制效应。MDE不仅存在多成分多靶点效应，而其中一些单分子本身也具有多靶点导向作用，即1个分子能同时对2个或2个以上的靶点产生作用，证明了中药及其复方多靶点治疗效应的物质基础。

由于流感及其续发病症发病机理涉及的信号转导通路和靶点繁复庞杂，相关机制也正在深入研究之中。作为一项探索性研究，本试验只选择了与流感及其续发病症病毒性肺炎明确相关的炎症机制中的几个关键靶点进行研究，靶标选择数量上略显不足。在后续工作中，靶标数目的增加，无疑将增强MDE多靶点导向效应的说服力度。

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