消渴脉康颗粒质量标准研究

何 洋 ，何绍斌 ，金 文 ，林以慈 ，罗钧锦 ，石 钺

（1.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193； 2.广州市悠好福医药科技有限公司，广东 广州 510610）

消渴脉康颗粒是由黄芪、枸杞子、桑寄生、赤芍、丹参、地黄、牛膝、延胡索等组方，由医学名著《医学心悟》中治疗消渴病的黄芪汤化裁而来，具有健脾益肾、活血通络之功效，用于治疗糖尿病周围神经病变。经过多年临床应用证实，其具有较好的临床疗效。为有效控制药品的质量，确保该制剂的临床疗效，本试验对组方中各药材建立了定性鉴别方法，对方中主药赤芍的有效成分芍药苷建立了高效液相色谱(HPLC)定量测定方法。试验结果显示，所建方法简便易行、灵敏准确、专属性强，可用于消渴脉康颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

CAMAG薄层色谱扫描仪；Waters 1525型高效液相色谱仪（Waters 1525系统，Waters 2487检测器，Mellennium32色谱工作站）；TU-1800型紫外分光光度计；KQ-250DB型数控超声波清洗器（220 V，250 W，40 kHz）；Mettler AB135-S 型十万分之一电子天平。枸杞子对照药材（批号为121072-201109）、齐墩果酸对照品（批号为 110709-201206）、原儿茶醛对照品（批号为110810-201007）、槲皮素对照品（批号为 100081-200907）、延胡索乙素对照品（批号为110726-201213）、黄芪甲苷对照品（批号为110781-200613）、芍药苷对照品（批号为110736-201337），均购自中国食品药品检定研究院。消渴脉康颗粒（广州市悠好福医药科技有限公司，批号为 20130404，20130405，20130406）。薄层层析用硅胶G和硅胶 GF254，购自青岛海洋化工厂。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱(TLC)定性鉴别

2.1.1 牛膝

取本品 10 g，研细，加甲醇 - 水（8 ∶2）100 mL，硫酸 1 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至20 mL，用石油醚（60～90℃）提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品，加乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺牛膝的消渴脉康颗粒同法制备阴性对照品溶液。照 2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B中TLC法试验，吸取上述3种溶液各 20 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿 -甲醇（40∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 A)。

2.1.2 丹参

取2.1.1项下石油醚提取后的水溶液，用乙醚提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取原儿茶醛对照品，加乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺丹参的消渴脉康颗粒同法制备成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB中TLC法试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶 GF254薄层板上，以氯仿 - 丙酮 - 甲酸（7.9 ∶1.1 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 B)。

2.1.3 枸杞子

取2.1.2项下乙醚提取后的水溶液，用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，提取液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取缺枸杞子的消渴脉康颗粒同法制成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB中TLC法试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯 -氯仿-甲酸（2.5 ∶2 ∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 C)。

2.1.4 桑寄生

取本品 20 g，研细，加甲醇 - 水（8 ∶2）100 mL，硫酸 1 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至20 mL，用石油醚（60～90℃）提取2次，每次20 mL，弃去，水溶液继续乙醚提取，提取2次，每次30 mL，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，加到聚酰胺1 g中，拌匀，干燥后，加至聚酰胺柱（2 g），先用30 mL水洗脱，弃去，继续用30 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺桑寄生的消渴脉康颗粒同法制成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB中TLC法试验，吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯（水饱和）-甲酸乙酯 -甲酸（5∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%三氯化铝乙醇溶液显色，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 D)。

2.1.5 延胡索

取本品20 g，研细，加水100 mL，加热回流4 h，滤过，滤液通过AB-8型大孔吸附树脂柱（内径2.0 cm，长10 cm），以水100 mL洗脱，弃去水液。再用10%乙醇50 mL洗脱，弃去10%乙醇洗脱液，续用95%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液70 mL，浓缩至10 mL，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺延胡索的消渴脉康颗粒同法制成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB中TLC法试验，吸取上述3种溶液各20 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏数秒钟后，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 E)。

2.1.6 黄芪

吸取 2.1.5项下供试品溶液 5 mL，蒸干，残渣加30 mL水溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，加到硅胶1 g中，拌匀，干燥后，加至2 g硅胶柱，用30 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺黄芪的消渴脉康颗粒同法制备成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B中 TLC法试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯（365 nm）下显相同的橙黄色荧光斑点，阴性对照品溶液色谱则无此斑点(见图1 F)。

2.2 芍药苷HPLC法定量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦公司 Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氢钾（29 ∶71）；流速：1.0 mL /min；柱温：30 ℃ ；检测波长：230 nm；进样量：10 μL。

图1 薄层色谱图

2.2.2 溶液制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.117 2 mg的溶液，即得对照品溶液。取消渴脉康颗粒（批号为20130404）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。根据消渴脉康颗粒处方，取除赤芍外的其他处方量药材，按质量标准制备方法制成阴性对照品。按供试品溶液制备方法操作，即得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别取 2.2项下 3种溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。理论板数以芍药苷峰计大于3 000；供试品溶液色谱中芍药苷与相邻峰为基线分离，分离度大于1.5；阴性对照品溶液色谱中无芍药苷的色谱峰，说明测定无干扰。见图2。

线性关系考察：分别精密量取对照品溶液 3.0，5.0，7.0，10.0，13.0，15.0 μL 注入高效液相色谱仪中，按拟订色谱条件测定，以对照品进样量（X）为横坐标、相应峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y＝130 584 X-137 510（r＝ 0.999 5）。结果表明，芍药苷进样量在 0.266 4 ～ 1.332 0 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，按拟订色谱条件测定5次。结果的 RSD为0.98%(n＝5)，表明仪器精密度较高，可靠性强。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，4，6，8 h 时各测定 1 次。结果的 RSD 为 0.28%(n＝5)，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品（批号为20130404）5份，按拟订色谱条件测定芍药苷的含量。结果的 RSD为2.37%(n＝5)，表明方法重现性较好。

加样回收试验：取批号为20130404的样品（芍药苷含量0.325 3%）研细，取约 0.5 g，精密称取 6份，分别加入对照品溶液10 mL，按供试品溶液的制备方法操作，精密吸取供试品溶液10 μL，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

图2 高效液相色谱图

表1 芍药苷加样回收试验结果(n＝6)

2.2.4 样品含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样，测定3批次样品中芍药苷的含量。结果批号为20130404，20130405，20130406的 3批次样品中芍药苷的平均含量分别为 32.53，33.19，32.94 mg /g。

3 讨论

本品具有健脾益肾、活血通络之功效，用于治疗糖尿病周围神经病变。赤芍为方中要药，具有活血通经之功效，有效成分芍药苷具有扩张血管、镇静、镇痛、抗炎等作用。故选择芍药苷作为本品的含量测定指标，与本品的功能具有较高的相关性。

用50%乙醇为提取溶剂，对回流法和超声法处理样品进行比较，结果表明，超声法提取效率较高，故选用超声法提取芍药苷。用 50% 乙醇为提取溶剂，分别采用超声 10，20，30，40，60 min进行提取。结果表明，超声40 min可以提取完全，故选择40 min为样品提取时间。

流动相选择中，分别考察了乙腈-0.1%磷酸溶液[1]、甲醇-水等系统[2-4]的不同配比。结果表明，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾（29∶71）为流动相最为理想，此条件下芍药苷与其他成分能够较好地分离，阴性无干扰，且样品处理方法简单，可作为本品质量控制的理想方法。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：96-97.

[2]梁 帅，王路宏，李 岩.高效液相色谱法测定复光颗粒中芍药苷含量[J].中国药业，2012，21（15）：40-41.

[3]李玉英，吴俊贤，郑 惠，等.高效液相色谱法测定尪痹片中芍药苷含量[J].中国药业，2013，22（11）：43-44.

[4]邓双炳，石 岩，胡玉花，等.HPLC测定脾肾两助丸中芍药苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：123-125.