正交试验法优选化癥止痛巴布剂乙醇提取工艺

罗德祥，梁晓燕，陈 丽，雷凯君，李子鸿

（广东省佛山市中医院，广东 佛山 528000）

化癥止痛巴布剂处方是我院使用多年的抗癌止痛标本兼治的临床验方，由蟾酥、徐长卿、三七、细辛、红花、延胡索、制马钱子、冰片等中药组方[1]，具有清热解毒、化痰散结、活血止痛、化攻毒的功效，对痰热毒瘀互结所致癌痛有较好的疗效。原临床使用是将药材粉碎为细粉制成散剂，用蜂蜜或水调匀成糊状敷贴患处。为了提高疗效和方便临床使用，根据各味药所处的地位和药物成分的特性，拟将化癥止痛散各味药采用合适方法提取后制成巴布剂。笔者通过正交试验探讨化癥止痛巴布剂的乙醇提取工艺，以总浸出物和其主要有效成分丹皮酚的含量为指标，寻找最佳提取工艺条件，并对制剂质量进行有效控制。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括Waters 1525型高压泵、717型自动进样系统、2996型二极管阵列检测器、Empower工作站（美国Waters公司）；Mettler AE200型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；H66025MC型超声发生器（无锡市超声电子设备厂）。丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110708-200506）；徐长卿对照药材（中国药品生物制品检定所，批号为121514-200501）；其他药材均购自广州致信药业有限公司，经鉴定为正品；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺设计

采用 L9（34）正交试验，设置乙醇浓度（因素 A）、乙醇用量（因素B）、回流时间（因素C）、提取次数（因素 D）4个因素，每个因素进行3水平考察，以徐长卿中有效成分丹皮酚的提取量及浸膏得率为评价指标，进行正交试验。因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 总浸出物测定

按处方比例精密称取各药材粗粉共50 g，其中徐长卿药材8 g，共9份，分别按表1中的正交设计方案提取。精密称取提取液10 g，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置干燥箱内105℃干燥至恒重后，置干燥器中冷却0.5 h，迅速精密称定质量，计算浸膏得率。浸膏得率(%)＝干膏重/样品重×100%。结果见表2。

2.3 丹皮酚含量测定[2-4]

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Xterra RP 18 柱(250 mm × 416 mm，5 μm)；流动相：乙腈 - 水(55 ∶45)；流速：1.0 mL /min；检测波长：274 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液制备

精密称取丹皮酚对照品5.2 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含丹皮酚0.208 mg的对照品溶液。按处方比例精密称取各药材粗粉共50 g，其中徐长卿药材8 g，共9份，分别按表1中正交设计方案提取，精密吸取各正交设计方案所得提取液1 mL，挥干溶剂后用甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，即得供试品溶液。按比例称取不含徐长卿的其他药材，用70%乙醇回流提取，依照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

阴性干扰试验：分别吸取丹皮酚对照品溶液、5号供试品溶液、缺徐长卿的阴性对照品溶液各20 μL，按拟订色谱条件进样检测。结果丹皮酚对照品溶液、供试品溶液在相同时间内出现丹皮酚特征吸收峰，且与其他组分峰分离较完全，缺徐长卿阴性对照品溶液无干扰。见图1。

线性关系考察：分别精密吸取丹皮酚对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件测定峰面积，记录色谱图。并以对照品进样量(X)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝49 983.51 X-450 172.87（r＝ 0.999 8）。结果表明，丹皮酚进样量在 0.208～2.08 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

回收率试验：精密量取同一供试品提取液10 mL，共6份，分为3组，分别加入丹皮酚对照品溶液适量，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，并定容于10 mL容量瓶中，精密量取10 μL进样，按拟订方法检测，计算得回收率为97.61%，RSD为1.36%。

重复性试验：精密量取同一供试品提取液6份，按供试品溶液制备方法制备，在拟订色谱条件下测定。结果丹皮酚平均含量为 1.41%，RSD为1.26%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：吸取同一供试品溶液 10 μL，分别于 0，2，4，8，12，24 h时依法测定。计算丹皮酚峰面积的 RSD为1.47%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 样品含量测定

精密吸取1～9号供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，计算丹皮酚含量。结果见表2。

图1 高效液相色谱图

表2 正交设计方案和试验结果

2.4 正交试验结果分析

按方差分析理论得方差分析结果，见表3至表5。由表2可见，影响丹皮酚提取量、浸膏得率及综合得分的因素的大小顺序分别为：A＞C＞D＞B，A＞C＞B＞D，A＞C＞D＞B。由表 3和表 4可见，乙醇浓度对丹皮酚提取量和浸膏得率均有显著性影响，回流时间对丹皮酚提取量有显著性影响。结合表5综合得分方差分析结果，可得最优醇提工艺为A2B2C1D3。但因因素D影响不明显，并考虑节约生产成本，故确定优选工艺为A2B2C1D2，即加入10倍量的70%乙醇回流提取2次，每次回流提取时间为1 h。

表3 丹皮酚含量方差分析

表4 浸膏得率方差分析

表5 综合得分方差分析

2.5 验证试验

为了进一步验证正交试验结果的准确性，以确保提取工艺合理可行，按上述最优工艺条件A2B2C1D2，重复安排3批试验，结果见表6。结果表明，按醇提工艺A2B2C1D2所提得的丹皮酚含量、浸膏得率都接近正交试验中的最大值。因此，此工艺稳定，具有重复性和可操作性。

表6 验证试验结果

3 讨论

采用正交设计，确定了醇提工艺的最佳条件，即加入10倍量的70%乙醇回流提取2次，每次回流提取时间为1 h。正交试验结果分析，乙醇浓度对浸膏得率和丹皮酚提取量均有较大影响，乙醇浓度较低时提取的浸膏得率虽高，但丹皮酚含量却较低；同时回流时间对丹皮酚提取量也有显著性影响，时间越长，提取量反而降低，这些可能与丹皮酚水溶性较差、熔点低而易挥发造成损失有关。

中药复方制剂中的丹皮酚含量测定多采用高效液相色谱法，文献报道多采用甲醇-水的流动相系统，且比例各不相同，有80 ∶20，75 ∶25，55 ∶45，52∶48 等。本试验曾试验比较乙腈 -水、甲醇-水两种流动相，以乙腈-水为流动相所得色谱峰峰形好，分离效果较优，故本试验最终选择乙腈-水(55∶45)为流动相，获得了较好的分离度。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：201.

[2]潘洪平，陈 英，符翠莉.高效液相色谱法测定桂枝茯苓胶囊中丹皮酚含量[J].中国中药杂志，2002，27(8)：591.

[3]龚淑珍.HPLC法测定杞菊地黄丸中丹皮酚的含量[J].江西中医学院学报，2000 ，12(3)：157.

[4]湛文青，李 华.HPLC法测定徐长卿中丹皮酚的含量[J].中药材，2004，27(2)：104.