均匀设计法优选酸枣仁抗抑郁有效组分配伍研究＊

赵启铎，舒乐新，高 岚

(天津中医药大学，天津 300193)

酸枣仁Zizyphi Spinosi Semen 为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.Var. Spinosa (Bunge) HU ex H.F.Chow 的干燥成熟种子[1]，具有补肝、敛汗、宁心、生津之功效，用于虚烦不眠、体虚多汗、惊悸多梦、津伤口渴等证，《本草纲目》将其列为上品。前期研究表明，酸枣仁中抗抑郁作用有效组分为总脂肪油、总黄酮、总皂苷[2-4]。基于中药复方协同作用，本研究中采用均匀设计法对酸枣仁中3 种抗抑郁作用的主要成分进行配伍研究，以筛选出酸枣仁抗抑郁组分的最佳配伍比例。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

雄性ICR 小鼠，SPF 级，体重(20±2)g，购于天津市山川红实验动物科技有限公司，合格证号为SCXK(津)2009-0001，在饲养环境下适应1 周后使用。室温为(22±2)℃，相对湿度为65% ～70%。光照12 h，自由摄食、饮水。

炒酸枣仁(天津中新药业集团有限公司)，经天津中医药大学药学院中药鉴定教研室张丽娟教授鉴定)，自行提取，分离得到总脂肪油(SY)、总黄酮(SH)、总皂苷(SZ)备用;盐酸氯米帕明片(北京诺华制药有限公司，批号为X0026，规格为每片25 mg)，用前用2%吐温-80 水溶液配制成1 g/L，备用。

试验材料悬尾装置自制，木棒上用木板隔离成4 个分区，用胶带固定鼠尾;强迫游泳所需的2 000 mL 烧杯7 个;BP 211D 型万分之一分析天平(上海君达仪器厂);秒表(瑞士霍耶尔- 奥利达斯厂)。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药

将提取的酸枣仁总脂肪油、总黄酮、总皂苷3 种抗抑郁的有效组分作为考察因素，每个因素各设7 个水平(见表1)，按均匀设计表U7 ×(76)及其使用表进行安排，共得7 种组方，具体配伍见表2。以前期研究[1-3]的有效剂量为依据，分别确定剂量范围为总脂肪油10 ～100 mg/kg，总黄酮10 ～100 mg/kg，总皂苷10 ～100 mg/kg。

表1 因素水平表(mg/kg)

表2 灌胃给药方案(mg/kg)

取ICR 小鼠90 只，随机分为9 组，每组10 只，按表2 设计的剂量灌胃给药，同时设空白对照组(KB 组)和盐酸氯米帕明(25 mg/kg)阳性对照组(YX 组)，给药体积为10 mL/kg，每日1 次，连续给药7 d。

1.2.2 不同配伍的酸枣仁有效组分药效学评价

小鼠强迫游泳试验:参照文献[5]。将单个小鼠放入水深10 cm烧杯(直径13 cm，高19.5 cm)中，水温(25 ±2)℃。观察6 min，记录后4 min 小鼠游泳的不动时间(指小鼠在水中停止挣扎，或显漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面)。试验结束将小鼠放在取暖设备下烘干，放回笼内。

小鼠悬尾试验:参照文献[6]。强迫游泳试验小鼠饲养3 d，每天灌胃给药1 次，末次给药后1 h，将单个小鼠尾端(在距尾2 cm处)用胶布粘在木棒上部，使其成倒挂状态，头部离台面15 cm，中间以挡板隔离小鼠视线。小鼠为了克服不正常体位而挣扎活动，活动一段时间后出现间断性不动，显示失望状态。观察6 min，记录后4 min 内小鼠不动时间为失望时间。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对小鼠强迫游泳和悬尾试验不动时间的影响

结果见表3 和图1。

表3 各组小鼠强迫游泳和悬尾试验结果(± s，n=10)

表3 各组小鼠强迫游泳和悬尾试验结果(± s，n=10)

注:与KB 组比较，＊P ＜0.05，▲P ＜0.01。

组别KB 组A 组B 组C 组D 组E 组F 组H 组YX 组强迫游泳不动时间(s)165.1 ±26.9 126.8 ±48.4＊127.9 ±48.4＊127.1 ±41.3＊128.4 ±36.3 129.8 ±36.8 127.4 ±30.4＊123.5 ±38.1＊125.8 ±35.4＊悬尾不动时间(s)106.7 ±29.4 79.5 ±19.4＊78.3 ±27.7＊81.9 ±27.3 77.5 ±27.8▲81.1 ±26.1▲78.5 ±18.3＊75.5 ±31.9＊58.3 ±31.2▲

图1 酸枣仁有效部位不同配伍对小鼠强迫游泳和悬尾试验不动时间的影响

2.2 总脂肪油、黄酮及皂苷的最优配伍组合

以小鼠强迫游泳不动时间为指标，经二次多项式逐步回归法对小鼠不动时间试验数据进行处理，得到抗抑郁药效(Y)与酸枣仁有效组分配伍之间的关系，方程为 Y1=108 +0.890 X1+0.856 X2-0.249 X3-0.022 1 X1X2(X1为总脂肪油，X2为黄酮，X3为皂苷)，α=0.05，方程调整后r=0.931 0，F=3.255，P=24.9，回归方程不显著。

以小鼠悬尾试验不动时间为指标，经二次多项式逐步回归法对小鼠不动时间试验数据进行处理，得到抗抑郁药效(Y)与酸枣仁有效组分配伍之间的关系，方程为Y2=80.3+0.012 6 X1+0.053 5 X2-0.052 1 X3-0.000 621 X1X2，α=0.05，方程调整后r=0.999 9，F=1 825，P=0.062 2，D- W 统计量d=0.010 0。回归方程显著，此方程中各因素最优组合为X1=10 mg/kg，X2=100 mg/kg，X3=10 mg/kg。

2.3 酸枣仁抗抑郁组分配伍方验证试验结果

ICR 小鼠40 只，随机分为4 组，各10 只。分别为对照组、阳性对照组[盐酸氯米帕明(25 mg/kg)]、酸枣仁抗抑郁组分配伍方组(即总脂肪油10 mg/kg+总黄酮100 mg/kg+总皂苷10 mg/kg)和酸枣仁药材组(生药794 mg /kg)。连续给药7 d，用小鼠悬尾试验不动时间作为药效学评价指标。结果见表4 和图2，酸枣仁抗抑郁组分配伍方和药材组小鼠悬尾试验不动时间与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)。抗抑郁组分配伍方组与酸枣仁药材组相比，小鼠悬尾试验不动时间缩短，其抗抑郁作用优于药材组，表明该组分配伍方有较好的抗小鼠试验性抑郁作用效果。

表4 酸枣仁抗抑郁组分配伍方对小鼠悬尾试验不动时间的影响(± s，n=10)

表4 酸枣仁抗抑郁组分配伍方对小鼠悬尾试验不动时间的影响(± s，n=10)

注:与KB 组比较，＊P ＜0.05。

-25 794(生药)-空白对照组(KB)盐酸氯米帕明组(YX)酸枣仁药材组(SYC)酸枣仁配伍方组(SKF)117.60±28.53 69.90±25.83＊80.10±33.98＊70.30±22.89＊)-40.6 31.9 40.2

图2 酸枣仁抗抑郁组分配伍方对小鼠悬尾试验不动时间的影响

3 讨论

本研究所用总脂肪油、总皂苷、总黄酮提取方法是根据3种有效组分的极性等差异建立的一种系统提取分离法。分别利用石油醚提取法、正丁醇萃取、大孔吸附树脂分离纯化制备各组分。

杨奕等[7]采用均匀设计法对酸枣仁中抗抑郁组分进行了配伍研究，以其中的总生物碱、总黄酮、总皂苷作为研究对象，验证试验表明，最佳配伍为总生物碱17.8 mg/kg+总皂苷113.4 mg/kg。笔者的前期研究结果表明，酸枣仁中的脂肪油、总黄酮、总皂苷具有明显的抗抑郁活性，且均不能增加小鼠自主活动次数，可见其抗抑郁作用和增加小鼠自主活动无关[2-4]，因此采用均匀设计方法对酸枣仁中3 种主要有效组分最佳配伍进行研究。相比传统的正交设计法，均匀设计在要考察的因素水平较多时，可减少试验次数，只需要与因素水平数相等次数的试验即可达到正交设计的试验效果[8-11]。

本研究所优选的是抗抑郁作用组分配伍关系。通过小鼠强迫游泳试验及小鼠悬尾试验，考察小鼠强迫游泳试验及小鼠悬尾试验的不动时间，作为评价抗抑郁作用的药效学指标。试验结果表明，酸枣仁各有效组分组合均有不同程度的抗抑郁效果。运用相关软件分析，得出回归方程，可观察到各组分对作用效果的贡献大小及优化用量的信息。统计分析及验证试验结果证明，总脂肪油、总皂苷、总黄酮是酸枣仁发挥抗抑郁药效的有效组分，其组合后的药效优于药材组，最优配伍为总脂肪油10 mg/kg+总黄酮100 mg/kg+总皂苷10 mg/kg。

本研究结果与文献报道的总生物碱17.8 mg /kg +总皂苷113.4 mg /kg 差异很大，可能是由于研究对象不同，在药效学上的反映不同。对于均匀设计法在中药有效组分配伍的应用及酸枣仁抗抑郁组分配伍方发挥抗抑郁作用的机理，有待深入研究。

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