shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

梁大敏，束 波，杨加伟，生 欣，范 芳

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病机制和病因尚不明确。DNA双链断裂(double-stranded breaks，DSBs)是细胞最严重的一种损伤，可导致细胞失去分裂增殖能力而死亡，是抗癌药物致肿瘤细胞死亡主要机制。DNA依赖性蛋白激酶亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是参与非同源重组修复(nonhomologous end-joining，NHEJ)的核心组分，在NHEJ、VDJ重组和维持端粒结构中起关键作用，同时可磷酸化诸多转录因子和修复基因[1-2]。除此之外，有研究报道DNA-PKcs与肝癌耐药有关[3-4]。本文将shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞株BEL7402/5-FU，通过检测DNA-PKcs沉默对细胞化疗药物敏感性的影响，初步探索shDNA-PKcs与肝癌耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 BEL7402/5-FU细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA质粒购于百奥迈科生物科技有限公司，Lipofectamine®2000Reagent购于Invitrogen公司，DNA-PKcs抗体购自Assay biotech公司，P-Glycoprotein(P-gp)抗体购自abcam公司，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 shRNA质粒提取与鉴定 按质粒提取试剂盒提取质粒，经BamH I、Hind III双酶切后，琼脂糖凝胶电泳(1.0 %琼脂糖，120 V，30 min)，拍照。另取菌液1 mL送至百奥迈科生物技术有限公司测序。

1.2.2 BEL7402/5-FU细胞的培养 将BEL7402/5-FU细胞于含10 %胎牛血清、20 μg/mL 5-FU的1 640培养液，37 ℃、5 %CO2条件下培养。细胞贴壁生长，每天换液1次，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.3 实验分组与质粒转染 实验分为4组：空白对照组、脂质体组、空质粒组、shDNA-PKcs实验组。将BEL7402/5-FU细胞接种于6孔培养板，每孔种8×104个细胞，当细胞融合度达到80%左右时吸去培养液，将质粒-脂质体复合物加至相应培养孔中，每孔200 μL，6 h后换液。48 h后荧光显微镜下计数，转染率=每个视野下的荧光细胞个数/相同视野下的细胞总数×100 %。

1.2.4 Real-time PCR检测DNA-PKcs mRNA水平的表达 细胞总RNA的提取按Trizol® Reagent试剂盒说明书进行，Real-time PCR引物：DNA-PKcs上游5′-GTGACAAGGCAACTGTATGAGC-3，下游3′-TTCTCTAAAAACACCAGCCACA-5′，扩增片段长度163bp；β-actin上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3，下游3′-GGAGCGACAGGTGGAAGGTC-5′，扩增片段长度206bp。

各组样品DNA-PKcs mRNA表达量经Real-time PCR仪检测，PCR产物作熔解曲线分析，根据Ct值通过公式2-(△△CT)进行相对定量分析计算可得DNA-PKcs mRNA相对表达量。

1.2.5 Western blot检测DNA-PKcs、P-gp蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，按BCA法制作标准曲线，计算样品蛋白浓度。取50 μg蛋白样品与上样缓冲液混均，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h(RT，1 h)，孵一抗(4 ℃，过夜)，TBST洗膜3次。孵二抗(37 ℃，1 h)，TBST洗膜3次，ECL发光显色。用Quantity One定量分析软件分析灰度比。

1.2.6 MTT法检测药物敏感性 取BEL7402/5-FU细胞制成细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔种1×104个细胞，培养12 h后转染，6 h后弃培养基，分别按0、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL加入阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、顺铂(DDP)和按0、3、6、12、24、48、96、192 μg/mL加入5-氟尿嘧啶(5-FU)。48 h后弃培养液，加180 μL无血清培养液、20 μL MTT(0.5%)，继续培养4 h后弃上清，加150 μL二甲基亚砜(DMSO)，低速震荡10 min，全自动酶标仪(490 nm)测定各孔吸光度值。用Graphpad prism5.0计算各个药物的IC50。

2 结果

2.1 shDNA-PKcs质粒的鉴定 酶切电泳结果显示：shDNA-PKcs质粒组、阴性质粒组约6300bp(见图1)。shDNA-PKcs质粒测序结果显示质粒插入序列如下：GATCCGGGCGCTAATCGTACTGAA TTCAAGAGATTCAGTACGATTAGCGCCCTTTTTTA。

2.2 荧光计数检测shDNA-PKcs质粒的转染率 结果显示：shDNA-PKcs质粒转染效率约为62.2%(见图2)。

2.3 Real time PCR检测DNA-PKcs、P-gp mRNA水平表达 实验结果使用2-△△Ct法进行分析，结果显示(见表1)：空白对照组、脂质体组、质粒对照组DNA-PKcs、P-gp mRNA表达无明显差异(P>0.05)，shDNA-PKcs实验组DNA-PKcs、P-gp mRNA的表达较对照组明显下调(P<0.01)。DNA-PKcs mRNA水平的沉默效率为82.6 %。

注：1：shDNA-PKcs质粒组；2：阴性质粒组。图1 酶切电泳结果

注：A:普通光源;B:荧光光源。 图2 shDNA-PKcs质粒细胞水平转染效率(×100)

分组DNA-PKcs mRNA水平(Ct值)P-gp mRNA水平(Ct值)β-actin mRNA水平(Ct值)DNA-PKcs相对倍数变化(2-△△Ct)P-gp相对倍数变化(2-△△Ct)空白对照组23.133±0.16423.010±0.21317.207±0.3371.000±0.0001.000±0.000脂质体组22.493±0.13522.400±0.15816.630±0.4781.045±0.1011.026±0.095质粒对照组22.680±0.27422.657±0.32117.047±0.6901.226±0.0521.144±0.053实验组26.013±0.562**24.307±0.494**17.537±0.4680.174±0.083**0.512±0.014**

注：**:与空白对照组相比P<0.01。

2.4 Western blot检测DNA-PKcs、P-gp蛋白水平表达 结果显示：空白对照组、脂质体组、质粒对照组DNA-PKcs、P-gp表达无明显差异(P>0.05)，shDNA-PKcs实验组DNA-PKcs、P-gp蛋白表达均下降，与对照组比较差异都具有统计学意义(P<0.01)，DNA-PKcs蛋白水平的沉默效率为71.8%(见表2，图3)。

分组DNA-PKcs/β-actinP-gp/β-actin空白对照组1.214±0.2061.254±0.269脂质体组1.237±0.1351.301±0.053质粒对照组1.118±0.2121.167±0.120实验组0.282±0.032**0.225±0.001**

注：**:与空白对照组相比P<0.01。

2.5 MTT法检测BEL7402/5-FU细胞的药物敏感性 结果显示(见表3)：空白对照组、脂质体组、质粒对照组对ADM、DDP、MMC、5FU的IC50差异

注:1：空白对照组；2：脂质体组；3：质粒对照组；4：shDNA-PKcs实验组。 图3 各组细胞DNA-PKcs、P-gp蛋白的表达

不明显(P>0.05),而shDNA-PKcs实验组对ADM、5FU IC50降低，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。可见DNA-PKcs的沉默可增加肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU对ADM、5FU的敏感性。

分组ADMDDPMMC5-FU空白对照组25.905±1.05010.539±1.3673.042±0.67386.980±4.278脂质体组24.705±1.0259.517±3.5472.654±0.72384.070±5.742质粒对照组23.860±2.94210.569±1.8112.718±0.50983.415±5.230实验组14.260±2.450*4.625±0.0211.243±0.19563.720±6.028*

注：*:与空白对照组相比P<0.05。

3 讨论

肝癌是一个最常见的、致命的肿瘤。目前临床上常采用手术联合放化疗，但长期放化疗后，易出现耐药，这可能与DNA损伤信号失调和DNA损伤修复有关[5-6]。其中，由电离辐射或抗癌药物如：阿霉素(拓补异构酶II抑制剂)等引起的DSBs是最严重的损伤。然而，在哺乳动物细胞中以DNA-PK为核心的非同源重组修复(non-homologous end joining，NHEJ)在DSBs修复的中发挥主要作用。

DNA -PKcs由4128个氨基酸组成的相对分子量为469 kD的大分子量蛋白质，基因位于染色体8 ql1，含有一系列磷酸化位点以及高度保守区[7]。DSBs发生后，DNA-PKcs与Ku70/80结合到DNA末端，通过自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如：Artemis、DNA ligase4、XRCC4和Cernunnos等完成DNA损伤修复[8]。DNA-PKcs被认为具有肿瘤抑制功能，能维持基因组稳定性[9]。大量研究发现，在许多肿瘤患者经放化疗后，DNA-PKcs蛋白表达活性增加，且DNA-PKcs表达量的多少直接影响肿瘤的进一步治疗。因此，本实验采用RNAi技术沉默DNA-PKcs，检测肝癌细胞对4种常用化疗药物的敏感性，结果发现沉默后能够明显增加肝癌细胞对ADM、5-FU的敏感性。目前已有一些研究表明下调DNA-PKcs能增加肿瘤细胞对药物的敏感性[10-11]。然而，在耐顺铂的神经胶质瘤患者、口腔癌放疗患者中已发现DNA-PKcs活性增加[12]，表明放化疗后机体产生了耐药性。为了进一步了解BEL7402/5-FU细胞耐药的可能机制，本实验用Real time PCR和Western blot法检测了各组细胞的多药耐药蛋白P-gp mRNA和蛋白表达情况。实验检测结果显示DNA-PKcs沉默后P-gp mRNA和蛋白表达减少，提示DNA-PKcs的沉默可能通过下调P-gp的表达，从而增加BEL7402/5-FU细胞对化疗药物的敏感性。因此推测DNA-PKcs沉默降低细胞耐药性的机制除了与抑制DNA损伤修复途径有关，还可能与下调P-gp表达存在一定的联系，具体机制还需作进一步的实验研究。目前也有少量研究表明通过抑制DNA-PKcs下调P-gp，从而增加耐药细胞对化疗药物的敏感性[3-4]。但DNA-PKcs如何调控P-gp逆转耐药，目前说法不一，还需要进一步研究。

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