CRISPR干扰：一种由假说到现实的基因沉默技术

齐 波, 丁 晶

(成都军区昆明总院 全军创伤骨科研究所，云南 昆明 650032)

在自然选择的驱动下，细菌对外源基因的入侵已进化出多种防御机制，当外源基因侵入细菌时，一种成簇而规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)会将该基因片段整合保存，待相同基因片段再次入侵时，CRISPR及其相关蛋白会将该外源基因剪切破坏，细菌这种免疫防御功能不禁让人联想到基因沉默技术，能否利用CRISPR构建出新的基因沉默新技术呢？当Qi等[1]的研究给出肯定的答案时便开启了基因研究的新篇章。本文旨在介绍CRISPR干扰(CRISPR inference, CRISPRi)系统的基本结构和功能。

1 CRISPR-Cas系统的结构及分类

1.1 CRISPR位点 1987年Ishino等[2]报道在大肠杆菌碱性磷酸酶的同工酶Ipa中有一段呈“重复-间隔-重复”规律排列的序列，尔后发现这种结构在细菌和古细菌中普遍存在，并于2002年由Jansen等[3]统一命名为CRISPR。这些重复序列有较高保守性，一般由23 bp-50 bp组成，其间有5 bp-7 bp的回文序列，通常于此形成稳定的茎-环结构；在同一个CRISPR位点，重复序列基本相同，但不同微生物有不同CRISPR位点，在同一微生物中可能有多个CRISPR位点，不同CRISPR位点所含重复序列各不相同[4-5]；许多重复序列还含有GAAA(C/G)3'-端保守基序，其可能是Cas蛋白的结合位点[5]。间隔序列长为17 bp-84 bp，在同一个CRISPR位点该序列不同，研究表明它们可能来源于噬菌体、质粒[6]。

1.2 Cas蛋白 2002年Jansen等[3]发现在CRISPR位点附近有一系列与之相关的基因(CRISPR-associated, Cas)，与之相对应的蛋白称为Cas蛋白，目前已从中鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶，解螺旋酶及RNA-和DNA-结合的结构域，由此推断Cas蛋白可能参与CRISPR的转录、加工等过程[7]。随着人们对CRISPR系统的关注，目前已发现40余种Cas蛋白。在CRISPR位点上游存在一段(A+T)富集的前导序列(lead sequence)，其在CRISPR转录过程中起启动子的作用[8]。一言蔽之，CRISPR-Cas系统包括：由重复序列及间隔序列规律排列的CRISPR簇、前导序列和Cas基因构成(见图1)。

注：A： 获得间隔序列，Cas蛋白发挥核酸内切酶活性剪切含有PAMs的外源基因，并将其整合到自身基因组中；B： crRNA的转录加工，整合后的CRISPR序列首先被转录为pre-crRNA，后者与tracrRNA形成复合体，随后RNase将其切割为crRNA；C： crRNA与Cas蛋白构成复合体，前者通过与靶基因互补配的方式保证特异性识别，Cas蛋白发挥核酸内切酶活性切断外源基因；D：若去除Cas蛋白核酸内切酶活性，即dCas蛋白，则阻碍靶基因转录，实现基因沉默。图1 CRISPRi系统的结构及其作用机制

1.3 CRISPR系统的分类 2005年Haft[5]等在分析了40种细菌和古细菌基因组后，依据Cas1系统发育树的拓扑结构及相应Cas蛋白组成和功能，将CRISPR-Cas系统分为：Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、Mtube共8个亚型。这种分类尽管简单易行，但却未考虑诸多Cas蛋白的远缘关系；其次，该方法也未考虑CRISPR-Cas系统在品类繁盛的细菌和古细菌中进化的复杂性；最终可能导致那些重组、杂交的CRISPR-Cas系统无法归类。鉴于此，Makarova等[9]提出将细菌整合间断序列过程纳入考虑，把CRISPR-Cas系统分为3类：Ⅰ型CRISPR-Cas系统特点是包含cas3的编码基因，其翻译的蛋白含有N-端HD磷酸水解酶和C-端解螺旋酶结构域，它们亦可分别由cas''、cas'基因编码，主要生物学功能是参与降解外源基因； Ⅱ型CRISPR-Cas系统的特征是含有cas9(或称csn1)基因，其编码的蛋白包含RuvC样核酸酶和HNH核酸酶结构域，后者有丰富的限制性酶并具内切酶活性，参与CRISPR RNA加工及剪切外源基因过程[10-11]；Ⅲ型CRISPR-Cas系统主要包括DNA/RNA聚合酶和RAMP(Repeat-associated mysterious proteins)组件，主要功能是参与间隔-重复序列转录过程及降解靶基因，根据其作用对象不同还可将该系统进一步分为Ⅲ-A和Ⅲ-B两种亚型，前者主要以外源DNA为靶标[12]，而后者可破坏外源RNA[13]。

2 CRISPRi的作用机制

2.1 CRISPR系统对外源基因的整合 获得外源基因是CRISPRi的首要步骤。当外源基因侵入细菌后，宿主体内的Cas蛋白会迅速与之结合，并发挥核酸内切酶活性将外源基因剪切为小片段后再将其嵌入前导序列与第一个重复序列之间，随后复制一段重复序列，保持“重复-间隔-重复-间隔”的序列结构(见图1A)。嵌入的前间隔序列(protospacer)长度大约为30 bp，该序列的选择并不是随机的，而是取决于前间序列5'-端或3'-端的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motifs，PAMs)，如化脓性链球菌、无乳链球菌及单核细胞增生李斯特菌的NGG基序，但并不是所有生物的PAMs都相同，这些差异可能与生物多样性有关[9, 14]。间隔序列既可来源于编码链，也可来自非编码链，无论是哪种来源都能使细菌获得沉默目的基因的免疫功能[15-16]。

2.2 CRISPR序列的转录 整合后的CRISPR序列首先被转录为CRISPR前体RNA(CRISPR precursor RNA, pre-crRNA)，后者再被进一步加工形成CRISPR源性小RNA(short CRISPR-derived RNA, crRNA)，其是实现CRISPRi的必要条件[15]。研究表明，前导序列可发挥“启动子”样作用启动转录，并沿下游单向进行，该过程依赖于cAMP信号传导[8, 17]。在pre-crRNA剪切加工为crRNA的机制首先在大肠杆菌K12中得到阐释，研究发现，CRISPR编码的Cas5e及Cse1-Cse4 5种Cas蛋白形成复合体，称为CRISPR相关抗病毒复合体(CRISPR-associated complex for antiviral defence, Cascade)，Cascade通过发挥核酸内切酶活性即可将pre-crRNA剪切为成熟crRNA[15](见图1B)；但Cascade并不是实现CRISPRi的必须路径，在化脓性链球菌中发现pre-crRNA有一段24 nt组成的tracrRNA(trans-encoded small RNA)，其通过激活RNaseIII及Cas9(亦称Csn1)即可完成上述过程[11]。成熟crRNA可分为5'-手柄、3'-发卡结构和间隔序，5'-手柄在具有保守性，3'-发卡是核酸内切酶识别位点[18]；5'-端重复序列均质性较3'-端好，其与PAMs一起保护自身CRISPR序列不被误切[19]；crRNA末端还含有一段起”种子区”作用的序列，它决定着寻找靶基因的效率，该区域仅需1个位点发生突变即极可能无法正确识别靶基因，但在种子区外发生少量突变则不容易导致识别功能失效[20]。

2.3 CRISPR系统沉默目的基因 准确找到目的基因是CRISPRi的关键步骤，crRNA与其相关Cas蛋白组装为CRISPR相关核糖核蛋白复合体，通过crRNA间隔序列与靶基因互补配对即能特异性识别侵入的外源基因。这种以RNA为导向的DNA识别不仅得以证实，且发现靶基因所在位点的双链DNA都会被Cas蛋白中的核酸内切酶剪切，即完成了RNA指导的DNA沉默(见图1C)[7, 10]。需要指出的是并非所有CRISPRi系统都以DNA为靶标，在Pyrococcus furious的体外实验中就发现大量RNA被剪切，但这种情况尚认为与入侵的基因类型有关，当外源基因为RNA时，CRISPRi即以RNA为靶标[13, 21]。crRNA与Cas蛋白的具体作用机制尚未完全阐明，但通过对比Cascade与靶基因结合前后的结构变化发现，Cas蛋白亚基沿着crRNA呈螺旋状排列，防止crRNA被降解，crRNA的5'-端和3'-端则形成特殊结构锚定在Cas蛋白上[22]。这种既紧密结合又能自身保护的结构，使CRISPR相关核糖核蛋白复合体在破坏一条外源基因后不会失效，还可继续攻击存在的其他外源基因。

3 CRISPRi系统的构建和运用

3.1 CRISPRi技术聚焦于Cas9 化脓性链球菌的CRISPR系统最为简单，仅由1条编码Cas9蛋白的基因、crRNA和tracrRNA构成，三者即足以完成上述RNA指导的DNA沉默过程，其中Cas9-crRNA复合体的功能首先是作为向导寻找靶基因和核酸内切酶作用位点，然后Cas9发挥核酸内切酶活性切除靶基因[23-24]。能否设计一条含靶基因的向导RNA(small guide RNA, sgRNA)模拟tracrRNA-crRNA复合体，让其与Cas9共同构成CRISPRi系统特异性沉默靶基因呢？新近研究表明，按上述方法构建的CRISPRi系统将293T细胞、K562细胞及多能干细胞等多种人细胞中的基因靶向切除[25-26]；且在同一系统中，仅需通过增加插入间隔序列的数量就能实现同时切除多个目的基因[27]；而这种技术的基因修饰效率至少与ZFNs (zinc finger nucleases)技术或TALENs(transcription activator-like TAL effector nucleases)技术相当[28]。

3.2 控制转录的CRISPRi系统 目前设计的CRISPRi系统直接将靶基因切断，这种方法可能更适合修改突变基因或在特异位点删除、插入基因片段，Qi等[1]设计的CRISPRi系统令Cas9蛋白核酸内切酶活性失活，避免靶基因被剪切，同时，由于CRISPRi系统与目的基因紧密结合而阻滞了转录过程，当CRISPRi系统被移除后，细胞又能恢复正常(见图1D)。CRISPRi与RNAi的主要区别在于前者在转录水平抑制RNA合成，而后者是通过Dicer介导mRNA降解。

4 展望

CRISPR是细菌抵御外源基因入侵的天然免疫屏障，人们一直致力于认识这种自然存在的基因沉默现象，但直至近年来才取得突破。尤其是Cas9的发现，不仅简明扼要地向人们阐释了CRISPR抗外源基因的基本机制，而且使这种生物现象得以在科学研究中运用[25-31]。CRISPRi技术不仅是基因功能研究的利器，而且可用于基因编辑以改良农作物，建立基因病动物模型和进行基因治疗[29-31]。这项技术被Science评为2013年十大科学进展之一，并将其功能总结为“Genetic Microsurgery for the Masses”。CRISPRi有以下突出优点：①这种干扰是直接阻滞DNA转录，而不像RNAi技术是破坏mRNA，阻滞级别更高、更准确；②可对多个靶点同时编辑；③实现可逆性基因沉默；④沉默效率较高，载体构建简单，只需设计目的基因的sgRNA。但建立在Ⅱ型CRISPR系统上的CRISPRi仅能编辑PAMs后的20 bp，Ⅲ型CRISPR系统实现的CRISPRi虽不收PAMs限制，但需多种Cas蛋白形成复合体发挥功能，这是进一步研究需要解决的问题。

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