新疆紫草中紫草素提取方法研究

张继业，杜 蕊，刘婷婷，杨范莉，童 华(.西安交通大学药学院，西安 7006，.陕西省眼科研究所，西安市眼科医院，西安市第一医院，西安 7000；3.西安交通大学第一附属医院，西安 7006)

新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst)是紫草科软紫草属植物，也称新疆软紫草。作为传统中药，新疆紫草具有多种生物学活性，如抑菌、伤口愈合、抗病毒、抗炎、抗癌、抗肿瘤等[1-2]，在临床上应用广泛。从紫草中分离提取出以紫草素为代表的萘醌类成分为其主要活性成分。同时紫草素也是良好的天然色素，已广泛用于食品和化妆品中。

目前报道的紫草素提取方法有溶剂萃取法、减压蒸馏法、超声提取法、微波提取法、超临界萃取法等[3-5]。但受成本和设备限制，可应用于大量生产的最优提取方法仍是传统的溶剂萃取法。而有研究发现，采用不同的溶剂提取紫草素会使得紫草提取物中紫草素含量差别较大，紫草素含量差异直接导致药理活性不同[6]。本文以紫草素的提取率为评价指标，选用4种常用的提取溶剂(石油醚、乙醇、氯仿、碱液)提取新疆紫草，筛选出最佳的紫草素提取方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 AY120电子分析天平(日本岛津公司)；LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；HWS-5A恒温水浴锅(上海百典仪器有限公司)；GENIUS 16K台式高速离心机(长沙市鑫奥仪器仪表有限公司)。

1.2试药 左旋紫草素对照品，购自南京狄尔格医药科技有限公司；紫草饮片购自同仁堂陕西分公司，并由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为新疆紫草；石油醚、氯仿、乙醇、氢氧化钠、盐酸、甲酸均为分析纯；乙腈为色谱纯(天津市科密欧试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1提取液的制备 取已干燥至恒质量的新疆紫草，粉碎过筛，精密称取5.0 g，分别用45 mL石油醚、氯仿、乙醇、10 g·L-1氢氧化钠碱液浸渍，在室温避光条件下，搅拌30 min，过滤，药材残渣重复提取1次，合并两次滤液，得提取液，避光冷藏保存，待用。

2.2色谱条件 Waters XTerra®RP18色谱柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相采用二元体系，A为含0.5 mL·L-1甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为：0 min时A相为95%，30 min时B相升至100%，并维持10 min；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为276 nm；柱温为30 ℃；进样量为50 μL。

2.3对照品储备液制备 精密称取左旋紫草素对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得200 μg·mL-1紫草素对照品储备液。

2.4供试品溶液制备 精密量取1.0 mL紫草素提取液(石油醚提取液、氯仿提取液、乙醇提取液)，用乙醇稀释至15 mL，以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液作为供试品溶液。精密量取碱液提取液1.0 mL，加入1 mol·L-1盐酸溶液1.0 mL，待沉淀析出完全，加乙醇稀释至15 mL，以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液作为供试品溶液。

2.5专属性 取提取物样品按2.2项下色谱条件进行分析，记录色谱图，见图1，紫草素色谱峰峰形良好，无杂峰干扰，保留时间为19.63 min，该方法具有良好的专属性。

2.6标准曲线 精密量取相应体积紫草素对照品储备液，置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制质量浓度为12，10，8，6，4，2 和0.2 μg·mL-1对照品溶液。分别取上述溶液，按2.2项下色谱条件进行分析。以各对照品质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得紫草素标准曲线方程：Y=75 870.975 2X+2 564.526 7，相关系数r=0.999 6。表明紫草素在0.2 ～12 μg·mL-1范围内线性良好。

图1 HPLC图

2.7精密度 精密量取6 μg·mL-1对照品溶液50 μL，按2.2项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。结果紫草素RSD为1.82%，表明本法精密度良好。

2.8稳定性 精密量取1 mL紫草素乙醇提取液，乙醇稀释至10 mL作为供试品溶液，将供试品溶液置于室温(25 ℃)条件下不避光保存。分别于0，2，4，6，8，10和12 h进样50 μL进行分析，紫草素峰面积RSD为8.51%，表明在室温不避光条件下，测定方法稳定性不能满足要求。将同一供试品溶液避光冷藏条件下保存，按上述方法测定，结果紫草素峰面积RSD为2.93%。证明在避光冷藏下，紫草素的测定结果稳定性良好，故在测定过程中样品应注意避光和冷藏。

2.9含量测定 按2.4项下的方法制备4种提取液供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定峰面积，用标准曲线计算紫草素的含量后换算成提取率。紫草素在碱液、氯仿、乙醇和石油醚中的提取率分别为0.996%±0.07%，0.785%±0.065%，0.982%±0.061%和0.568%±0.054%(n=3)。

3 讨论

实验结果显示，在3种有机溶剂中紫草素提取率差别较大(乙醇>氯仿>石油醚)，原因在于紫草素在3种有机溶剂中的溶解度不同。在室温条件下，在该投料量与溶剂比下，紫草素在乙醇中的溶解度最大，提取量最大。

4种提取溶剂碱液提取紫草素提取率最大。紫草中萘醌类成分虽为脂溶性成分，但紫草素及其衍生物可在碱液中成盐，溶解度增加，利于萘醌类成分的提取。碱液提取与有机溶剂提取相比，碱液提取时，提取物中强极性杂质成分较多，而酸沉再经乙醇萃取后，可去除一些强极性杂质，提取物中杂质含量减少。

有研究表明，紫草素具有光不稳定性，同时由于萘醌类结构中羟基存在使得紫草素也易被氧化。通过预实验获知，长时间置于空气中，紫草素的含量会下降。本实验在避光条件下，选择相对较短的提取时间(30 min)重复2次提取进行分析。

综上所述，碱提酸沉后经乙醇萃取为最适的提取方法，能够在提高提取物中紫草素含量的同时，降低提取物中杂质的含量。采用碱液提取能够有效节省有机溶剂的用量，减少成本，同时降低环境污染。

参考文献：

[1] Yin S Y，Peng A P，Huang L T，et al. The phytochemical shikonin stimulates epithelial-mesenchymal transition (EMT) in skin wound healing[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013，262796.

[2] 李翠芳，王芳，麻浩，等.新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究[J].河北农业大学学报，2010，33(3): 92-96.

[3] 李利红，樊国燕，陈虹.循环超声提取紫草素的工艺研究[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2013，33(1): 4-6.

[4] 王阳，朱燕霞，孙殿甲，等.均匀设计研究紫草的提取工艺[J].西北药学杂志， 2003，18(4): 157-158.

[5] 洪海龙，索全伶，韩利民，等.紫草色素的分离纯化及超细化研究[J].内蒙古工业大学学报：自然科学版，2009，28(3): 213-216.

[6] 赵雪梅，王桂玲，费洪荣，等.紫草有效成分的提取及其抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2008，24(4): 36-38.