中国汉族人群醛固酮合成酶基因编码区多态性

蔡 辉

(娄底市中心医院老年科，湖南 娄底 417000)

原发性高血压(EH)是多基因疾病。肾素-血管紧张素-醛固酮系统在血压调节方面起着重要作用。编码这个系统的基因的分子变异与一些心血管疾病密切相关，有报道其中的醛固酮合成酶基因(CYP11B2)的多态性-344C/T与EH、左心室肥厚、小动脉顺应性有关〔1〕。该基因属于细胞色素氧化酶(CYP)基因超家族，精确定位于染色体8q24.3，它含有9个外显子和8个内含子，与类固醇羟化酶(CYP11B1)基因具有高度同源性，核苷酸序列90%以上相同。位于该基因上的一些点突变可以引起醛固酮合成减少，而该基因启动子区-344C/T多态性与原发醛固酮增多症相关〔2〕。美国国家生物技术中心(NCBI)的核苷酸多态性(SNP)数据库报道了CYP11B2基因的11个错义SNPs和位于其他部位的 95个SNPs，数据主要由欧美人提交，不同人种SNP分布不同。本研究旨在寻找中国汉族人群中CYP11B2基因编码区序列的多态性。

1 对象与方法

1.1研究对象 31例血压正常人，年龄40～60岁，收缩压<135 mmHg，舒张压<85 mmHg。32例EH病人，年龄40～60岁，收缩压>140 mmHg和(或)舒张压>90 mmHg，排除继发高血压等。24例初步诊断原发醛固酮增多患者，血浆醛固酮与血浆肾素活性的比值(ARR)>50，血浆醛固酮的水平>正常参考值〔(5.79～17.39)ng/dl〕，排除继发醛固酮增多症。

1.2相关指标测定 ①血压测定：采用标准袖带台式血压仪，按照标准血压测定方法读取血压值，以Krotokof第1音为收缩压，第5音为舒张压，每间隔2 min测量1次，共测量3次取平均值。②血浆肾素活性与血浆醛固酮的测定采用放射免疫法(RIA)，醛固酮放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3基因组DNA提取 常规酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定其纯度和浓度后，标化DNA浓度为200～300 ng/μl，-20℃保存备用。

1.4引物设计 利用Primer 5.0和oligo6.0软件，以NCBI中的序列(D13752)为参考，针对CYP11B2的外显子和内含子交界处设计引物，引物由北京奥科公司合成。PCR反应试剂购自大连宝生物公司。见表1。

表1 CYP11B2各对引物序列

1.5PCR扩增 50 μl反应体系包含：10×PCR 缓冲液5 μl，2.5 mmol/L MgCl24 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，10 μmol/L上游引物1 μl，10 μmol/L下游引物1 μl，DNA 200～300 ng，Taq酶 0.5 U，消毒去离子水补充至50 μl。反应条件：95℃ 5 min，95℃30 s，退火及延伸条件见表2，共32个循环。反应产物经1%～1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查结果，并将目的条带割下。

1.6产物回收及测序 按照晶美生物公司的DNA Extraction Kit的说明书进行目的片段的纯化回收。将回收产物送往北京奥科公司，以PCR引物为测序引物进行测序。

1.7SNP的筛选 采用Blast，DNAMAN软件进行多重序列比对。

表2 各对引物的退火温度及延伸时间

1.8统计分析 统计所发现的SNPs数目及各SNP特征，计算每个SNP的基因型频率和等位基因频率，与GenBank上公布的数据进行比较。再通过在线 (http：//pga.gs.washington.edu/VG2.html)，EMLD软件和Haploview软件进行连锁不平衡分析，并通过在线 (http：//pga.gs.washington.edu/VH2.html)和PHASE2.0进行单体型构建。组间基因型和等位基因分布及单体型频率差异均采用SPSS12.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1所检测区域的SNPs概况 经CYP11B2基因全部外显子和部分内含子的序列扩增并测序，总计检测到序列为4 580 bp，发现18个多态性位点，有6个SNPs，位点在国外数据库中未见报道，占33%。有一个有意义位点，G5821A。其余的为同义突变或者位于内含子区。见表3。

表3 CYP11B2基因SNPs情况

1)此处SNP位置参考GenBank上的序列(D13752)；435G/S：435甘氨酸/丝氨酸；rs编号为NCBI中dbSNP库中的号码，显示突变位点(下划线处)两侧邻近10个碱基序列

2.2SNPs频率分布和类型 在18个SNPs中，根据同一位点次要基因频率，将其分为低频(<0.05)，其中SNPs为 5个；中频(0.05～0.15)，SNPs为6 个；高频(>0.15)，SNPs为7 个。各组间SNP等位基因频率和基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3部分SNPs在不同人种中的分布 见表4。

2.4CYP11B2外显子和部分内含子测序图 黑色箭头为突变位点。见图2。

2.5连锁不平衡分析和单体型构建 通过对这些SNPs位点进行在线连锁不平衡分析发现其中位点1205与1441，3497与3499和3803，3868与3881，存在完全连锁不平衡，r2=1；位点4918与5160存在较强连锁，r2=0.9，见图3和表5。对其中的9个SNPs位点进行单体型分析。其中7种单体型占85.4%，频率均大于2%，分别为56%，10.8%，4.8%，3.6%，3%，2.4%。

图1 可视化基因型分布图

图2 CYP11B2外显子及部分内含子基因测序图

图3 连锁不平衡分析图

表4 CYP11B2基因部分SNPs次要等位基因在不同人种中的分布

另外通过PHASE2.0软件进行精确的单倍体构建，结果与上述在线分析一致。两种主要单体型111111111111和111101111111的频率在三组中均大于10%，能解释69%、64%、75%的个体。在单体型110111111111中原发醛固酮增多症组和另外两组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；111100000111在原发醛固酮增多症组中占5%，而在另外两组中不存在。见表6。

表5 两位点间连锁不平衡分析(通过EMLD软件)

表6 12个SNP位点组成的7种主要单体型(通过PHASE2.0软件)

3 讨 论

第三代遗传标记单链SNP是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式，这种多态性包括单个碱基的缺失和插入以及单个碱基的置换。SNP为一种二等位基因变异，大多数为转换，转换与颠换之比为2∶1，在GC序列出现最频繁。SNP分布不均匀，由于选择压力等原因，绝大多数SNPs位于非转录序列。SNP其意义与位置有关：调控区SNP可能影响蛋白表达的水平，编码区SNP可能导致氨基酸残基改变，这两种SNP都可以导致蛋白质功能改变〔3〕。

人醛固酮合成酶主要位于肾上腺皮质球状带，它能催化脱氧皮质酮变成皮质酮，另外它还具有18-羟化酶活性和18-氧化酶活性，分别催化皮质酮变为18-羟化皮质酮和催化18-羟化皮质酮变为醛固酮。其编码基因CYP11B2基因含有9个外显子和8个内含子，与CYP11B1基因相隔40 kb，两者具有高度同源性，编码区序列同源性为95%，内含子序列同源性为90%，蛋白质相似性为93%。两者都编码503个氨基酸残基，分子量分别为48.5 kD和50 kD。为了能够保证特异性扩增出CYP11B2的外显子，而不是CYP11B1，首先通过Blast(www.ncbi.nlm.gov/blast)仔细比对这两个序列的各个外显子和内含子，然后在差异明显处设计引物的3′末端。

通过对CYP11B2基因9个外显子和部分内含子序列测序，将结果与已知的SNP信息进行比较，确定CYP11B2基因SNP在中国汉族人群中分布的具体位点和类型：总共检测出18个多态性位点，14个为转换，即嘌呤变成嘌呤，嘧啶变成嘧啶。4个位于编码区，其中3个为同义突变，分别位于第37、374、390个氨基酸处，变异频率分别为22%，11.7%，1%，GenBank上登录的rs编号分别为rs5281，rs4538，rs5313。同义改变不会改变氨基酸但可能会改变剪切部位而影响蛋白质的表达。1个为错义突变，位于第435个氨基酸处，由甘氨酸变成丝氨酸，变异频率为23%，rs编号为rs4545。已有研究发现在一例原发醛固酮合成减少(皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏)的病人DNA序列中存在该变异，体外蛋白质功能研究表明该突变可以导致18-羟化酶活性和18-氧化酶活性受损〔4〕。而本次研究中，这个变异在高血压组中发现，此病人该处的变异为一杂合突变，并且在整个测序区段中只发现这一个变异，其他17个多态性位点均未检测到，而该病人的肾素、醛固酮水平正常。此现象似乎与上述研究结果有矛盾之处，但上述皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏的病人的基因变异为纯合突变，考虑为基因剂量效应的影响。

剩下的14个变异均位于内含子区，有6个未见国外数据库报道，分别是G949A，A1441G，T1457C，T4880C，T4881G，C5264T。次要等位基因频率分别为43%，14.6%，1%，22%，22%，2.1%。C1205T国外SNP数据库未见登录，但Nicod等〔5〕在6个糖皮质激素抑制的醛固酮增多症(GRA)病人中检测到有5个病人存在这个变异，因此认为该变异是一种多态。其余7个在国外数据库中有报道，rs4538在中国汉族人群中的次要等位基因频率为11.7%，而在国外2种人群中频率为25%和32.5%。rs4545在中国北京人和日本人群中A等位基因频率分别为53.3%和46.6%，而在欧洲和非洲人群中分别为1.7%和2.5%，这表明该位点在亚洲黄种人群中的分布类型与欧美白人和非洲黑人相比存在很大的差异。rs5281次要等位基因A频率为2.2%，与国外报道的2.5%基本一致。rs5313次要等位基因A频率为1%，而在国外人群中为15%，推测可能与样本量较少有关，也有可能是种族差异所致。rs6399，rs6418次要等位基因T频率均为22.7%，国外人群为均32.5%。rs6434，rs10110732，rs13252628，rs28531895，rs36018151国外数据库未见频率报道。据中国少数汉族人群样本数据显示，中国汉族人群的SNP分布特点与国外报道的不尽一致，充分说明SNP存在种族遗传性和地区遗传性。

Gordon〔6〕对肾上腺皮质腺瘤(APA)做了很深入的基因分析，报道了在肾上腺皮质瘤组织里肾素的mRNA水平增加，但编码肾素，AT1受体，P53的基因均未找到突变。Yoshiyu等〔7，8〕在APA病人体内也没找到突变。Jaresch等〔9〕研究了APA病人体内醛固酮分泌增多是否由CYP11B1基因突变引起，但他们未发现突变。21-羟化酶缺乏参与了肾上腺皮质肿瘤的形成〔10〕，Beuschlein等〔11〕研究了21-羟化酶的编码基因CYP21的mRNA变化，发现mRNA显著增高和一个突变点Val281Leu，但这个变异被认为是个多态性。同样，他们对特发型醛固酮增多症(IHA)病人的CYP11B2基因编码区测序也未能找到突变。本研究也未在中国原发醛固酮增多病人中找到有意义的突变。这些结果提示了CYP11B2基因的某些调控因素比如未确定的刺激醛固酮生成物质或者是基因启动子区的异常导致了CYP11B2 mRNA过量表达。

连锁不平衡分析表明有9个SNPs存在较强或者完全连锁不平衡现象，单体型构建发现1种单体型在原发醛固酮增多组中频率要高于其他两组，推测这种单体型可能与原发醛固酮增多有关，但本研究的样本量不够大，尚需要加大样本量研究。

中国汉族人群CYP11B2基因编码区多态性位点的分布与频率与国外人群相比存在着种族差异。这些多态性位点和单体型为今后的定点突变研究和大样本人群进行病例-对照关联研究提供了实验基础。

4 参考文献

1Sookoiana S，Gianottia TF，Gonzálezb CD，etal.Association of the C-344T aldosterone synthase gene variant with essential hypertension：a meta-analysis〔J〕.Hypertension, 2007；25：5-13.

2Kupari M，Hautanen A，Lankinen L，etal.Associations between human aldosterone synthase (CYP11B2) gene polymorphisms and left ventricular size，mass，and function〔J〕.Circulation,1998；97：569-75.

3Takor HK，Risch NJ，Myers RM.Opinion:candidate-gene approaches for studying complex genetic traits：practical considerations〔J〕.Nat Rev Genet,2002;3：391-7.

4Kuribayashi I，Kuge H，Santa RJ，etal.A missense mutation (GGC〔435Gly〕-->AGC〔Ser〕) in exon 8 of the CYP11B2 gene inherited in Japanese patients with congenital hypoaldosteronism〔J〕.Horm Res, 2003；60(5)：255-60.

5Nicod J，Dick B，Frey FJ，etal.Mutation analysis of CYP11B1 and CYP11B2 in patients with increased 18-hydroxycortisol production〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2004;214:167-74.

6Gordon RD.Primary aldosterone：a new understanding〔J〕.Clin Exp Hypertens,1997；19：857-70.

7Yoshiyu Takeda.Genetic alterations in patients with primary aldosteronism〔J〕.Hypertens Res,2001；24：469-74.

8Takeda Y，Yoneda J，Demura M，etal.Cardiac aldosterone production in genetically hypertensive rats〔J〕.Hypertension,2000；36：495-500.

9Jaresch S，Kornely E，Kley HK，etal.Adrenal incidentaloma and patients with homozygous or heterozygous congenital adrenal hyperplasia〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,1992；74：685-9.

10Salisbury BA，Pungliya M，Choi JY，etal.SNP and haplotype variation in the human genome〔J〕.Mutat Res,2003;526；53-61.

11Beuschilein F，Schulze E，Mora P，etal.Steriod 21-hydroxylase mutations and 21-hydroxylase mRNA in human adrenocortical tumors〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,1998；83：2585-8.