甲胎蛋白修饰的树突状细胞诱导抗肝癌免疫作用的研究

陈国梁

(金华市人民医院，浙江 金华 321000)

树突状细胞(DC)是人体中功能最强的抗原呈递细胞，可对抗原进行高效摄取、加工以及呈递。甲胎蛋白(AFP)属糖蛋白，源于胚胎肝脏细胞，待胎儿出生两周后逐渐从血液中消失。最近有研究显示原发性肝癌患者体内甲胎蛋白含量普遍较高，因此众多科研工作者开始考虑甲胎蛋白用于肝癌患者进行生物治疗。本研究采用甲胎蛋白修饰的树突状细胞诱导抗肝癌免疫，实验结果良好，现报道如下。

一、材料与方法

(一)AFP修饰DC细胞的制备。

人肝癌细胞株BeL-7402购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，将其制备为热休克肿瘤细胞(Bel-7402)冻融抗原。选择12例健康志愿者，年龄为21-43岁，平均年龄为(31.8±4.2)岁，均抽取其外周血 50-100mL，分别将其单个核细胞进行分离，采用10%的胎牛血清培养基进行细胞悬浮培养，培养温度设置为37℃，含5%CO2贴壁2h之后，洗去非贴壁淋巴细胞，采用 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(500U/ml)将其诱导为未成熟的DC，培养至第6天，将其分为两组，对照组仅采用原先的GM-CSF和IL-4继续培养，而观察组加入AFP(甲胎蛋白)阳性的肝癌细胞株Bel-7402，即采用冻融抗原负载诱导。两组均在诱导24h之后采集DCs，采用流式细胞仪对细胞表型进行分析，采用荧光标记观察CD80、CD86以及HLA-DR等的表达情况。

(二)成熟DC诱导T淋巴细胞活化检测。

对成熟DCs刺激 T淋巴细胞的活性进行检测，采用ELISPOT试剂盒，对照组将诱导成熟DCs刺激诱导T细胞，而观察组将AFP阳性的冻融抗原诱导成熟DCs去刺激诱导T细胞。两组均在37℃和5%CO2中孵育24-48h，之后观察释放IFN-γ的激活T细胞数。

(三)成熟DC体外诱导特异性肝癌CTLs的检测。

选择12例HLA-A2阳性志愿者提取出的自体非贴壁细胞淋巴细胞作为目标效应细胞，按照1 10比例各加入对照组和观察组诱导成功的成熟 DCs，培养5天后收获，采用DimerX技术观察两组细胞中特异性抗肝癌CTLs的百分率。

(四)统计学分析。

采用SPSS 18.0软件包进行数据分析，计量资料采用(±s)来表示，组间比较采用t检验，计数资料采用x2检验，当P＜0.05时，两组之间的差异具有统计学意义。

二、结 果

本研究结果显示观察组诱导的 DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR的比率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(t=10.16、4.66、15.89，P ＜0.05)(见表 1)。

表1 观察组和对照组的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

表1 观察组和对照组的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

CD80 CD86 HLA-DR对照组组别05 8.19±4.13 54.29±5.12 23.22±4.52观察组 32.33±7.12 65.16±6.25 58.24±6.15 t值 10.16 4.66 15.89 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.

ELISPOT检测结果显示，对照组中平均每105个T淋巴细胞可检测到的分泌 IFN-γ的斑点数为(11.25±2.33)个，显著低于观察组，差异具有统计学意义(t=36.85，P＜0.05)。

本研究结果表明，观察组中诱导CTLs结合表位肽A和表位肽B的阳性细胞数均显著高于对照 组，差异具有统计学意义(t=16.58、12.54，P ＜ 0.05)(见表3)。

表2 两组成熟DCs激活T细胞释放IFN-γ的ELISPOT分析(个，±s)

表2 两组成熟DCs激活T细胞释放IFN-γ的ELISPOT分析(个，±s)

组别 份数 斑点数对照组12 11.25±2.33观察组 12 101.62±8.17 t值 36.85 P 值 ＜0.05

表3 两组成熟DCs诱导CTLs的表位肽-DimerX的检测结果(%，±s)

表3 两组成熟DCs诱导CTLs的表位肽-DimerX的检测结果(%，±s)

组别 例数 表位肽A:DimerX 表位肽B:DimerX对照组 12 0.05±0.02 0.05±0.01观察组 12 1.06±0.21 1.10±0.29 t值 16.58 12.54 P值 ＜0.05 ＜0.05

三、讨 论

目前手术切除治疗肝癌较为彻底，但手术治疗后复发率高，尤以肝内复发最为显著。即使术后采取化疗措施，复发率仍不可小觑。DC属抗原呈递细胞，未成熟时迁移能力较强，而成熟后可激活初始T细胞，维持正常免疫应答。体内多数DC处于非成熟状态，受抗原刺激后即分化为成熟DC，表达出高水平的粘附因子[1]。目前针对于 DC的抗肿瘤免疫治疗潜力较大，已用于治疗黑色素瘤、肾细胞瘤和前列腺癌等[2-3]。甲胎蛋白是一种胚性糖蛋白，正常人体内 AFP水平很低，但出现肝再生、妊娠、生殖系统癌变或者原发性肝癌时多数患者血清中AFP水平均升高，尤其是原发性肝癌患者，其AFP值升高者大约占80%左右。因此甲胎蛋白是诊断原发性肝癌的特异性指标。

本文表明甲胎蛋白修饰的DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR所占比率均显著高于对照组(P＜0.05)，说明甲胎蛋白抗原诱导促使DC成熟，增强其呈递抗原功能。ELISPOT检测结果显示，甲胎蛋白修饰的成熟DC诱导T淋巴细胞，平均每105个T淋巴细胞可检测出分泌IFN-γ的斑点数显著高于对照组(P＜0.05)。这是由于成熟 DCs表面有较多HSP受体，该受体能够与T淋巴细胞相互作用，上调表面分子表达，提高IFN-γ分泌。本研究还发现甲胎蛋白修饰的成熟DCs诱导CTLs结合表位肽A和表位肽B的阳性细胞数均显著高于对照组(P＜0.05)，表明甲胎蛋白修饰的成熟DCs可激发特异性抗肝癌免疫应答。综上所述，甲胎蛋白修饰的树突状细胞在诱导抗肝癌免疫中疗效较好，值得临床推广。

[1]史继静，王 昕，常瑞霞，等.肿瘤抗原特异性CTL细胞联合树突状细胞治疗原发性肝癌的安全性和有效性评价[J].中国实用医刊，2013，40(24):93-95.

[2]岳玲玲，张连生，柴 晔，等.负载抗原的DC与CIK共培养对耐药乳腺癌细胞的杀伤作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2012，19(4):437-441.

[3]章 烨，朱寿兴，申小苏，等.多肽负载DC联合CIK治疗激素难治性前列腺癌的疗效[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2012，19(4):414-420.