药物对卵巢颗粒细胞和黄体细胞毒性的体外研究进展

万慧杰，佟继铭，张树峰☒

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

药物对卵巢颗粒细胞和黄体细胞毒性的体外研究进展

万慧杰，佟继铭，张树峰△☒

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

卵巢颗粒细胞；黄体细胞；生殖毒性；体外培养

1957-1961年的“反应停”事件引起全世界对生殖毒性的关注，揭开了药物生殖毒性研究的篇章。2006年11月，我国《药物生殖毒性研究技术指导原则》出台［1］，各界人士越来越关注生殖毒性。传统的动物生殖毒性研究需要大量的实验动物，周期长，工作量大，费用昂贵，且难以评价生殖毒性和阐明毒性机制。近年来，细胞分子生物学、基因技术等学科的飞速发展，使得体外检测技术和方法开始应用于动物体外生殖毒性机制研究，已由器官和细胞水平向着分子和基因水平方向发展，并且不断深入［2］。目前，国内外已创建了多种雌性生殖毒性体外研究方法，包括全胚胎培养技术和卵巢皮质薄片培养方法、颗粒细胞、黄体细胞、卵泡体外培养方法。

雌性生殖系统十分复杂，其内生殖器包括生殖腺（卵巢）、输送管道（子宫、输卵管和阴道）及附属腺（前庭大腺），外生殖器即外阴［3］，这些器官的功能受下丘脑、垂体和卵巢之间的精确调节控制。卵巢具有生殖和内分泌功能，是雌性下丘脑-垂体-性腺轴的中心器官。另外，卵巢激素还调控着雌性附属性腺器官的上皮形态和生殖道体液的化学组成及黏性等［4］。因此，卵巢毒性是雌性生殖毒理学研究的重点。卵巢中主要构成细胞有皮质细胞、髓质细胞、卵巢颗粒细胞、黄体细胞、卵泡细胞、门细胞等。目前，用于雌性生殖毒性体外研究的主要有卵巢颗粒细胞和黄体细胞。

1 卵巢颗粒细胞

1.1 卵巢颗粒细胞的结构与作用 颗粒细胞（GC）是卵泡内的最大细胞群，对卵泡的生长发育和闭锁起着重要的作用。伴随着卵泡的发育颗粒细胞也发生扩张与增殖，颗粒细胞从扁平颗粒细胞向立方颗粒细胞变化，增殖力增强，形成多细胞层［5］。随着卵泡内颗粒细胞数目的增多，促性腺激素受体开始大量表达。在卵泡刺激素（FSH）的刺激下，颗粒细胞发生增殖、分化，分泌卵泡液，使卵泡生长，并且细胞内的芳香化酶被激活，增加雌激素的产生［6］。雌激素和FSH协同促进颗粒细胞合成雌激素，维持着卵泡正常的生长发育。排卵后，卵泡周围的颗粒细胞分化成黄体细胞，黄体细胞分泌的激素对孕酮的分泌与妊娠具有重要作用［7］。

1.2 颗粒细胞体外培养体系的建立 基于颗粒细胞重要的生理功能，颗粒细胞生殖学和毒理学研究在雌性生殖毒性研究中占有重要位置。1975年，Channing等［8］第一次发现体外培养的卵巢颗粒细胞可发生结构和功能的分化。近些年来，已建立了人、猪和大（小）鼠的卵巢颗粒细胞体外培养体系。对于人类来说，体外研究的颗粒细胞主要来源于已经接受体外受精（试管婴儿）的患者，这些细胞的数量有限，生命有限，故体外培养人类颗粒细胞一直很困难［9］。实验室常采用未成年雌性大（小）鼠，皮下注射孕马血清促性腺激素（PMSG）作用48 h，采用机械分离方法-卵泡穿刺［10-11］释放卵巢颗粒细胞进行原代培养。目前，不断优化的卵巢颗粒细胞体外培养技术，为生殖毒性体外研究创造了良好的条件。

1.3 药物对卵巢颗粒细胞体外毒性研究 近年来，随着对生殖毒性研究的深入，已发现有很多药物对卵巢颗粒细胞有明显的毒性，如氯丙嗪、避孕药及一些中药等。

1.3.1 氯丙嗪：吩噻嗪类药物，具有镇静、抗精神病、镇吐、降温等作用，主要用来治疗人类的精神疾病。有关报道称，氯丙嗪通过引起动物和人类内分泌系统的不良反应而导致性功能障碍，使得卵巢功能降低。邬静等［12］进行大鼠颗粒细胞原代培养，观察不同剂量的氯丙嗪对卵巢颗粒细胞的影响，发现随着剂量的升高显著抑制大鼠卵巢颗粒细胞的增殖及雌二醇的分泌。

1.3.2 避孕药：主要是通过抑制排卵，改变子宫颈黏液，或是改变子宫及输卵管的活动方式达到避孕作用。研究表明［13］，抗孕激素米非司酮和18-甲基炔诺酮能明显抑制大鼠离体培养的卵巢颗粒细胞分泌孕酮，同时抑制人绒毛膜促性腺激素（HCG）诱导颗粒细胞分泌孕酮。

1.3.3 中药：研究发现，很多中药及中药化学成分一定程度上会抑制卵巢颗粒的增殖和激素的分泌。天然多酚类物质白藜芦醇在高剂量下能抑制卵巢颗粒DNA的合成，降低雌激素的血管内皮生长因子（VEGF） mRNA及蛋白的表达［14］。乌头类中药的主要毒性成分乌头碱，高剂量时可减少颗粒细胞数量，并引起细胞氧化损伤［15］。在加入莪术注射液进行颗粒细胞培养时，可观察到细胞破碎，核中出现染色质块，细胞器基本消失［16］。此外，研究发现［17］，治疗免疫性不育的复方中药消抗安胎提取液能抑制大鼠离体培养的颗粒细胞分泌雌二醇，其作用可能与该药会抑制CAMP-PKA信息传递系统有关。

2 黄体细胞

2.1 黄体细胞的结构与作用 黄体是排卵后卵巢中短暂存在的一个内分泌组织，其主要功能是分泌孕酮，从而支持卵泡的着床，并维持妊娠。黄体实质的主要部分是合成类固醇激素的黄体细胞，分为大黄体细胞（Large luteal cell，LLC）和小黄体细胞（Small luteal cell，SLC）。大的黄体细胞从卵泡颗粒细胞衍生而来，小的颗粒细胞由卵泡的膜细胞分化而来［18］。大小黄体细胞都能分泌孕酮，并且大黄体细胞还可以产生松弛素和催产素。此外，根据来源不同，将黄体细胞分为粒黄体细胞（Granulosa luteal cell）和膜黄体细胞（Theca luteal cell），粒黄体细胞主要分泌孕酮，膜黄体细胞一般位于黄体周边，主要合成雌激素［19-21］。

2.2 黄体细胞体外培养体系的建立 黄体细胞的生长、发育与凋亡、退化是雌性生殖系统中重要的生殖调节过程。体外培养黄体细胞进一步为研究生殖毒性及毒性机制提供了又一实验技术手段。有研究者收集当地屠宰场处于排卵期牛或猪的卵巢，经过酶消化得到黄体细胞。实验室目前常采用未成年雌性大（小）鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG），促进卵泡发育；48h后，颈部皮下注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），促进排卵，使黄体形成；6天后，颈椎脱臼处死，取出卵巢，通过酶消化法进行黄体细胞原代培养［22-23］。目前，通过对大（小）鼠黄体细胞体外培养条件的优化，黄体细胞体外培养体系越来越成熟。

2.3 药物对黄体细胞体外毒性研究 黄体细胞的实质功能是分泌孕酮等类固醇类激素，参与生殖系统的调节。黄体分泌孕酮不足会引起诸多异常生殖结果，如早期流产、不孕等。故药物对黄体细胞产生影响后，必将影响雌性生殖系统的正常功能。体外毒性研究表明，乌头类中药的毒性成分乌头碱达到一定浓度时，可能通过影响黄体细胞的结构和功能，使得细胞数量减少，孕酮分泌量下降［24］。郑利萍等［25］利用体外培养的黄体细胞，发现紫草多糖可直接作用于黄体细胞，并可能通过CGMP介导抑制HCG诱导黄体细胞分泌功能。

3 结语

目前，在生殖生物学和生理学中已建立了卵巢细胞体外培养方法，该方法在药物生殖毒性研究中主要用于较为明确的雌性生殖毒性机制研究。中药组成成分复杂，产生毒性的机制也相当复杂。中药对雌性动物生殖系统的毒性研究仍主要以整体动物研究为主，难以确切评定中药的生殖毒性及机制。因此，卵巢细胞体外培养用于研究中药对雌性生殖毒性是当前一个热点。

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1004-6879（2015）03-0247-03

2014-11-28）

（综述讲座栏目编辑：张玉亭）