葡萄糖氧化酶和细胞色素C对盐生杜氏藻细胞密度及β—胡萝卜素积累的影响

刘伟 王婷 冯佳 吕俊平 刘琪 谢树莲

摘要：为了解外源物质对盐生杜氏藻（Dunaliella salina）生长和β-胡萝卜素积累的影响，本试验以分离自运城盐湖的一株盐生杜氏藻（D.salina YCOI.）为材料，在培养基中添加外源葡萄糖氧化酶和细胞色素C，研究其对盐生杜氏藻细胞密度和p一胡萝卜素含量的影响。结果表明，葡萄糖氧化酶浓度9mg/L、细胞色素C浓度lμmol/L时，盐生杜氏藻细胞密度和β-胡萝卜素含量同时最大，因此，为两种外源物质的最优添加浓度。

关键词：盐生杜氏藻；葡萄糖氧化酶；细胞色素C；细胞密度；β-胡萝卜素

中图分类号：S555⁺.6

文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）01-0040-04

β-胡萝卜素（β-Carotene）呈橙黄色，分子式为C40 H56，广泛存在于植物及真菌中，被认为是一种重要的抗癌物质，具有抗氧化、增强免疫、防治心血管疾病、抗辐射和光敏损伤以及转化为维生素A等作用，对放疗产生的副作用有一定的减缓功效。β-胡萝卜素还被世界卫生组织和联合国粮农组织食品添加剂联合专家委员会认定为A类营养色素，在全世界50多个国家和地区作为食品添加剂和着色剂使用。

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是一种单细胞嗜盐藻类，也是一种重要的经济藻类。它是生产β-胡萝卜素的天然资源，其合成和积累的β-胡萝卜素可高达干重的14%，具有良好的市场前景。盐生杜氏藻的培养及β-胡萝卜素的积累机理在20世纪90年代前后就有报道。之后，盐生杜氏藻培养的关键技术及影响因素、二步培养法等陆续报道。我国也有关于盐生杜氏藻培养方面的研究报道。章丽等从盐生杜氏藻中克隆了影响β-胡萝卜素积累的关键酶β-胡萝卜素羟化酶基因，并对其进行表达分析，研究其对β-胡萝卜素合成的调控作用。

有报道称添加外源葡萄糖氧化酶和细胞色素C可促进β-胡萝卜素的积累，但其对盐生杜氏藻β-胡萝卜素合成的影响尚未见报道。本试验以分离自山西运城盐湖的一株盐生杜氏藻为材料，通过在培养基中添加不同浓度的葡萄糖氧化酶和细胞色素C，研究其对细胞密度和β-胡萝卜素合成的影响，以期为优化培养条件、最大限度获取β-胡萝卜素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

试验所用盐生杜氏藻藻种（Dunaliella salinaYC01.）分离自山西省运城盐湖。

培养基为Dunaliella培养基，pH 7.5，光照强度20000 lx，温度（25±1）℃，光周期16h：8h，每日摇动数次。

试验所用试剂均为分析纯。试验所用仪器主要有光照培养箱（SPX-250B-G，上海博讯）；紫外可见分光光度计（752PC，上海光谱）；生物显微镜（SK200，麦克奥迪）；全自动制冰机（IMS-30，常熟雪科）；超声波细胞粉碎机（SCIENTZ-IID，宁波新芝）；高速冷冻离心机（HC-2518R，中科中佳）。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄糖氧化酶浓度优化初步优化：设置7个葡萄糖氧化酶浓度梯度，分别为0、2、5、8、12、16、20mg/L。每个梯度设置3个重复。培养14d后测定细胞密度和β-胡萝卜素含量。

精细优化：以初步优化结果为依据，加入由初步优化得到的最佳葡萄糖氧化酶浓度范围，设置5个浓度梯度，每个梯度设置3个重复。培养14d后测定细胞密度和β-胡萝卜素的含量。

1.2.2 细胞色素C浓度筛选 根据上一步试验结果，加入葡萄糖氧化酶最佳浓度，再加入细胞色素C，设置4个浓度梯度，分别为0、1、2、3卜Lmol/L。每个梯度设置3个重复。培养14d后测定细胞密度和β-胡萝卜素的含量。

1.3 数据处理

分别采用PASW Statistics 18.O、Oringin 8.0以及Photoshop CS5软件对试验数据进行分析和做图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖氧化酶浓度的初步优化

从图1可以看出，在试验范围内，当葡萄糖氧化酶浓度较低时（≤8mg/L），盐生杜氏藻细胞密度随着葡萄糖氧化酶浓度的升高而升高，但是当葡萄糖氧化酶浓度较高时（≥8mg/L），盐生杜氏藻细胞密度随着葡萄糖氧化酶浓度的升高而下降，细胞密度最高范围出现在葡萄糖氧化酶浓度8-12mg/L之间。

从图2可以看出，在试验范围内，葡萄糖氧化酶对盐生杜氏藻β-胡萝卜素含量的影响与细胞密度变化趋势一致。当葡萄糖氧化酶浓度较低时（≤8mg/L），盐生杜氏藻β-胡萝卜素含量随着葡萄糖氧化酶浓度的升高而升高，但是当葡萄糖氧化酶浓度较高时（≥8mg/L），盐生杜氏藻β-胡萝卜素含量随着葡萄糖氧化酶浓度的升高而下降，β-胡萝卜素含量最高范围也出现在葡萄糖氧化酶浓度8～12mg/L之间。

2.2 葡萄糖氧化酶浓度的精细优化

精细优化是以初步优化的结果为依据，设置5个浓度梯度，分别为8、9、10、II、12mg/L。

从图3可知，在设置的葡萄糖氧化酶浓度梯度范围内，盐生杜氏藻的细胞密度虽有一些波动，但无显著性差异。

从图4可以看出，在设置的葡萄糖氧化酶浓度梯度范围内，盐生杜氏藻的β-胡萝卜素含量有一定差异，当浓度为9mg/L时，β-胡萝卜素含量最高，且相对其它处理有显著性差异。

综合盐生杜氏藻细胞密度和β-胡萝卜素含量的研究结果，葡萄糖氧化酶的最优浓度为9mg/L。

2.3 细胞色素C对盐生杜氏藻细胞密度和β-胡萝卜素含量的影响

从图5可以看出，与对照相比，添加外源细胞色素C可使盐生杜氏藻细胞密度增加，且呈显著性差异；但各处理间，盐生杜氏藻细胞密度无显著性差异。

从图6可以看出，细胞色素C对盐生杜氏藻β-胡萝卜素的含量有影响。当细胞色素C浓度为1μmol/L时，β-胡萝卜素含量显著高于其它处理。

综合上述，适宜盐生杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累的最佳细胞色素C浓度为1μmol/L。

3 讨论与结论

在β-胡萝卜素合成代谢途径中，β-胡萝卜素羟化酶是体系的关键酶，它能以β-胡萝卜素为底物，催化生成玉米黄质。β-胡萝卜素羟化酶是一种非血红素双铁单加氧酶，其作用机制为通过获得光合电子传递链中铁氧还蛋白传递的电子，在含铁的酶活性中心利用活化的分子氧去打断该酶的相关化学键而起作用。β-胡萝卜素羟化酶的活化严格依赖分子氧的存在并以铁氧还蛋白为电子供体，因此寻找该酶的活性抑制剂，调控相关过程，对促进盐生杜氏藻β-胡萝卜素的积累非常重要。

研究表明，葡萄糖能够诱导藻类和植物体β-胡萝卜素羟化酶基因的表达，因而不利于β-胡萝卜素的积累。有氧条件下，葡萄糖氧化酶专一性地催化β-D-葡萄糖等底物的降解，进而下调β-胡萝卜素羟化酶基因的表达。同时，该催化反应发生时消耗分子氧使体系中的活性氧分子甚至是氧原子减少，进而抑制β-胡萝卜素羟化酶的活性。因此，葡萄糖氧化酶的存在有利于β-胡萝卜素的积累。

细胞色素C属于线粒体内膜呼吸链上的传递蛋白，从细胞色素C还原酶接受电子传递给细胞色素C氧化酶。外源细胞色素C能够将光合作用过程中由铁氧还蛋白传递给β-胡萝卜素羟化酶的电子转移，使其得不到电子而失去相应的活性，因而可以对相关底物起到保护作用。

本试验即通过转移电子和适度去除培养体系中的活性分子氧进而抑制β-胡萝卜素羟化酶的活性，以达到增加β-胡萝卜素积累的目的。从试验结果看，当葡萄糖氧化酶浓度为9mg/L、细胞色素C浓度为lμmol/L时，盐生杜氏藻的生长和β-胡萝卜素积累效果最佳，为该藻的大量培养提供一定参考。