丙酮酸激酶在大肠癌组织中的表达水平研究

王翠瑶，张小玉，田苗苗，张秀梅

(锦州医科大学 生物化学教研室，辽宁 锦州 121000)

丙酮酸激酶在大肠癌组织中的表达水平研究

王翠瑶，张小玉，田苗苗，张秀梅Δ

(锦州医科大学 生物化学教研室，辽宁 锦州 121000)

目的 研究丙酮酸激酶M1型(PKM1)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)在大肠癌临床样本中的表达水平，探讨其与大肠癌发生发展的相关性。方法 分别采用Western blot法检测大肠癌临床标本和新鲜大肠癌组织及癌旁组织中PKM1 和 PKM2蛋白表达水平；分析PKM1、PKM2蛋白表达与大肠癌发生发展的相关性。结果 Western blot和免疫组化结果均显示：与癌旁组织相比，癌组织中PKM1的表达水平明显降低(P<0.05)，PKM2的表达水平明显增高(P<0.05)。相关分析结果表明，PKM1与大肠癌患者年龄，性别，分期均无相关性，PKM2与病理分期密切相关(P<0.05)。结论 大肠癌组织中PKM1呈现低表达，PKM2高表达。且PKM2与大肠癌患者的病理分期成正相关。

丙酮酸激酶M1型 ；丙酮酸激酶M2型；大肠癌

恶性肿瘤由于其生长迅速，常常消耗大量的葡萄糖，即使在有氧的条件下也常常利用糖酵解来供能，这种代谢特征是70年前由Otto Warburg发现并首次报道，称为Warburg效应或有氧糖酵解[1]。糖酵解水平提高几乎是所有肿瘤组织和肿瘤细胞的生物学特性。丙酮酸激酶是糖酵解过程中的一个限速酶，其主要功能是催化磷酸烯醇式转变成丙酮酸。丙酮酸激酶已知具有L，R，M1，M2 4种同工酶，其表达差异取决于细胞和组织的代谢情况。L型丙酮酸激酶主要表达在糖异生旺盛的组织，如肝脏和肾脏；R型丙酮酸激酶主要表达在红细胞中；M1型丙酮酸激酶表达于能量消耗快速耗氧量大的组织，如肌肉和脑；M2型丙酮酸激酶表达在核酸合成旺盛的组织，比如胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞[2-4]。本研究旨在检测大肠癌临床样本中PKM1和PKM2的表达水平，以期为大肠癌的临床早期诊断和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源：选取辽宁医学院第一附属医院经大肠癌手术切除、并经病理确诊的大肠癌标本95例，标本对应的患者手术前均未进行化疗、放疗及生物治疗。另取辽宁医学院第一附属医院26例大肠癌患者行手术切除的新鲜大肠癌组织和癌旁组织。

1.1.2 主要试剂：兔抗人的PKM1、PKM2的多克隆抗体购自Cell signal公司，辣根过氧化物酶偶联的IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，免疫组化二抗试剂盒，DAB染色试剂盒购自中杉金桥公司。

1.1.3 仪器：Lumat LB 9507化学发光仪(德国Berthold technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot检测PKM1、PKM2蛋白表达水平：取临床新鲜癌组织和癌旁组织，加蛋白裂解液冰上裂解15 min，提取组织总蛋白，测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。电泳前，加入SDS样品缓冲液，100 ℃煮沸5 min，离心后上样，每孔蛋白含量30 μg，10%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5%BSA的TBST(pH7.4)室温摇动温育1 h进行封闭，封闭后的膜再分别与PKM1抗体、PKM2抗体(稀释比为1:1000)4 ℃温育过夜。经TBST洗涤后，辣根过氧化物酶偶联的IgG作为二抗(稀释比为1:5 000)室温温育2 h，洗膜后，ECL发光，Western blot成像系统采集图像，计算灰度值。

1.2.2 免疫组化方法检测PKM1、PKM2蛋白表达水平：脱蜡和水化：将大肠癌标本置于二甲苯中浸泡20 min，更换二甲苯后再浸泡20 min；无水乙醇中浸泡10 min；95%乙醇中浸泡5 min；90%乙醇中浸泡5 min；80%乙醇中浸泡5 min；再放入水中5 min。

抗原修复：采用高压热修复，在高压锅里加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至喷气后150 ℃ 2 min。

免疫组织化学染色：自然凉却后，滴加3%H2O2，室温静置10 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温15 min。甩去多余液体。滴加一抗30 μL，室温静置1 h再4 ℃过夜。PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗，37 ℃ 1 h；PBS洗3次，每次10 min；滴加试剂C，室温静置1 h；PBS洗3次，每次10 min；DAB显色1～10 min，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10 min；苏木精复染30 s，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片、镜检。

2 结果

2.1 Western blot法检测26例肠癌样本的PKM1及PKM2的蛋白表达水平 26例肠癌样本中有17例PKM1的表达水平明显低于癌旁组织，比例高达65.38%(P<0.05)。与癌组织相比，26例肠癌样本中有16例PKM2的表达水平明显升高，比例高达61.53%(P<0.05)。结果提示：在正常组织中，通常是表达PKM1；而在癌组织中，PKM2的表达水平明显升高；说明PKM1和PKM2的异常表达与肠癌的发生发展密切相关。见图1、表1、图2、表2。

图1 26例大肠癌组织和癌旁组织的PKM1蛋白表达水平比较N：癌旁组织；C：大肠癌组织Fig.1 Comparison of PKM1 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序号病例癌旁PKM1/β-actin癌序号病例癌旁PKM1/β-actin癌11.938±0.0541.234±0.074*140.417±0.0730.122±0.086*21.838±0.0980.334±0.028*150.923±0.0860.234±0.073*30.964±0.0721.024±0.035161.118±0.0431.235±0.08740.252±0.0570.862±0.068171.725±0.0321.078±0.056*51.138±0.0380.326±0.072*180.925±0.0540.568±0.064*60.414±0.0611.264±0.058191.434±0.0870.456±0.039*70.538±0.0650.144±0.056*200.916±0.0620.434±0.018*80.326±0.0730.156±0.053*210.837±0.0470.564±0.059*90.236±0.0350.342±0.073220.846±0.0290.478±0.051*100.236±0.0560.136±0.023230.346±0.0450.152±0.056*111.224±0.0231.028±0.043*240.175±0.0430.844±0.026120.535±0.0780.341±0.039*250.134±0.0542.348±0.076130.444±0.0760.878±0.057260.534±0.0660.321±0.039*

*P<0.05，与同组癌旁组织相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

图2 26例大肠癌组织和癌旁组织的PKM2蛋白表达水平比较N：癌旁组织；C：大肠癌组织Fig.2 Comparison of PKM2 protein levels between colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma in 26 patientsN:adjacent tissues to carcinoma;C:colorectal cancer tissue

序号病例癌旁PKM2/β-actin癌序号病例癌旁PKM2/β-actin癌10.128±0.0530.115±0.042140.634±0.0710.221±0.04620.243±0.0560.247±0.072150.134±0.0431.230±0.047*30.474±0.0720.324±0.051161.218±0.0562.135±0.035*40.134±0.0430.562±0.058*171.325±0.0532.878±0.056*51.038±0.0781.436±0.072*180.325±0.0281.568±0.056*60.114±0.0320.574±0.078*191.134±0.0360.534±0.04570.136±0.0660.446±0.022*200.906±0.0620.434±0.03480.114±0.0680.354±0.058*210.537±0.0460.364±0.05990.154±0.0710.236±0.024220.136±0.0250.436±0.032*100.236±0.0660.456±0.016230.134±0.0252.232±0.068*110.116±0.0760.358±0.023*240.365±0.0530.264±0.076120.134±0.0520.537±0.048*250.138±0.0660.518±0.085*130.534±0.0460.834±0.023*260.234±0.0580.621±0.068*

*P<0.05，与同组癌旁组织相比，compared with adjacent tissues to carcinoma

2.2 免疫组化方法检测PKM1及PKM2的蛋白表达水平 免疫组化染色结果显示，PKM1(棕黄色颗粒)分布于胞浆，靠近核的区域，癌旁组织染色明显深于癌组织。PKM2(棕黄色)分布在胞质或胞核，癌组织染色明显深于癌旁组织。见图3。

图3 PKM1 和PKM2的蛋白表达水平(×200)Fig.3 The expression level of PKM1 and PKM2 protein(×200)

2.3 PKM1和PKM2与大肠癌发生发展的相关性 根据样本的组化得分将样本分为2组，弱(组化赋分小于3分的为弱)和强(组化赋分大于3小于7为强)，数据显示：高表达的PKM2与pTNM分期(P=0.015)显著相关，而与年龄、性别、大小、侵润深度等无关。PKM1的表达水平与pTNM分期等均无关，见表3、表4。

表3 PKM2在大肠癌组织的表达

表4 PKM1在大肠癌组织的表达

3 讨论

大多数正常组织在有氧条件下都是通过葡萄糖的有氧氧化获取能量，只有在缺氧时才进行无氧糖酵解。肿瘤组织即使在氧供应充足时也主要是以无氧糖酵解获取能量。肿瘤细胞发生这种代谢重编程与恶性肿瘤所处缺氧微环境和糖代谢酶谱变化，特别是糖酵解关键酶活性的改变密切相关[5-8]。PKM是糖酵解途径中最后一个限速酶。有研究[9-10]表明：生长迅速的肿瘤细胞和正常细胞比较，其PKM2活力明显升高。

本研究采用Western blot方法检测了26例大肠癌样本PKM1及PKM2的蛋白表达水平，结果显示：PKM1的表达水平在癌旁组织中明显高于癌组织，而PKM2的表达水平在癌组织中明显高于癌旁组织。该结果表明：PKM2的表达水平在大肠癌中表达水平明显升高，而PKM1的蛋白表达水平在大肠癌中则明显降低，说明2者的表达可能与大肠癌的发生发展有关，与文献报道相一致[11]。本研究采用免疫组化方法检测了95例大肠癌组织的PKM1及PKM2的蛋白表达水平，结果显示：与癌旁组织相比，PKM2的蛋白表达水平明显升高，其表达水平与大肠癌的病理分期密切相关，而与性别、年龄、肿瘤大小等无关；PKM1的蛋白表达水平在癌旁组织略高于癌组织，但其表达水平与性别、年龄、病理分期均无关。综上所述，大肠癌组织中PKM1和PKM2的的表达水平与大肠癌的发生发展密切相关。

[1] Warburg,Wind F,Negalein E.The metabolism of tumor in the body [J].J Gen Physiol,1927,8(6):519-530.

[2] Zhou CF,Li XB,Sun H,et al.Pyruvate kinase type M2 is upregulated in colorectal cancerand promotes proliferation and migration of colon cancer cells[J].IUBMB Life,2012,64(9):775-782.

[3] Siegel R,Desantis C,Jemal A.Colorectal cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(2):104-117.

[4] Wong N,De Melo J,Tang D.PKM2,a central point of regulation in cancer metabolism[J].Int Cell Biol,2013:242513.

[5] Marie J,Levin MJ,Simon MP,et al.Genetic and epigenetic control of the pyruvate kinase isoenzymes in mammals.Isozymes[J].Curr Top Biol Med Res,1983(7):221-240.

[6] Mazurek S,Boschek CB,Hugo F,et al.Pyruvate kinase type M2 aits role in tumor growth and spreading[J].Semin Cancer Biol,2005,15(4):300-308.

[7] Yang W,Xia Y,Ji H,et al.Nuclear PKM2regulates β-catenin transactivation upon EGFR activation[J].Nature,2011,480(7375):118-122.

[8] Anastasiou D,Yu Y,Israelsen WJ,et al.Pyruvate kinase M2 activators promote tetramer formation and suppress tumorigenesis[J].Nature Chemical Biology,2012,8(10):839-847.

[9] Liu WR,Tian MX,Yang LX,et al.PKM2 promotes metastasis by recruiting myeloid-derived suppressor cells and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2015,6(2):846-861.

[10] 孙倩.M型丙酮酸激酶(PKM2)在肿瘤代谢和发生中的作用[J].基础医学与临床，2012，32(5)：462-467.

[11] 林萍，邓涛，叶彦，等.人结直肠癌组织中mT0R、HIF-la、PKM2的表达及临床意义[J].疑难病杂志，2015，14(4)：380-383.

(编校：吴茜)

Study on the expression of PKM levels in colorectal cancer

WANG Cui-yao, ZHANG Xiao-yu, TIAN Miao-miao, ZHANG Xiu-meiΔ

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo study the expression level of PKM1 and PKM2 in colorectal cancer tissue and explore the relationship between colorectal cancer progression and their expression level.MethodsThe PKM1 and PKM2 protein expression levels in colorectal cancer tissues and adjacent tissues to carcinoma were determined by Western blot and Immunohistochemisty method, and the relationship with colorectal cancer were discussed.ResultsWestern blot and Immunohistochemisty results all showed that, compared with adjacent noncancerous，the protein level of PKM1 decreases significantly in cancer tissues (P<0.05), while the protein level of PKM2 increases significantly in cancer tissues (P<0.05).The protein level of PKM1 is not relative with age，sex and stage of patients, but the protein level of PKM2 is relative with pTNM(P<0.05).ConclusionColorectal cancer tissues with low level of PKM1 and high level of PKM2, and PKM2 was related with TNM of patients.

PKM1; PKM2; colon cancer

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.12

辽宁省大学生创新课题(201410160012)

王翠瑶：女，本科，高级实验师，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail：1140379451@qq.com；张秀梅，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail：zhangxiumei9879@sina.com。

R736.1

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