壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌性及细胞相容性研究

李高青，桑青，崔凯

(聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252000)

壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌性及细胞相容性研究

李高青，桑青Δ，崔凯

(聊城大学 生命科学学院，山东 聊城 252000)

目的 以实验室自制的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶为材料，探讨其抑菌性及细胞相容性。方法 设置4组：A(含纳米银1×10-5的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)，B(含纳米银5×10-6的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)，C(含纳米银2×10-6的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)，D(壳聚糖温敏水凝胶，不含纳米银)。通过抑菌圈法测定4种样品对6种革兰阴性菌，1种革兰阳性菌，3种真菌的抑菌作用；以SRB法测定其浸提液的细胞相容性。结果 随着壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶中纳米银含量增加，抑菌作用增强，壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌作用优于壳聚糖温敏水凝胶；其浸提液无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。结论 壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶有望作为新型创伤敷料。

壳聚糖；纳米银；温敏水凝胶；抑菌性；细胞相容性

壳聚糖分子上有大量的羟基和氨基，易被化学修饰[1-4]，壳聚糖还能与金属离子形成离子配合物[5-7]，可得到一系列的壳聚糖衍生物，使其具有更多的生物学功能，拓宽了应用范围，尤其在医药领域中的应用研究有了长足进展。纳米银具有抗菌[8-10]、杀菌持久[11]、渗透性强、无耐药性[12-13]等特点，近年来，在医用材料的应用中受到了广泛的关注。

本实验制备壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶，探究其对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923等1种革兰阳性菌，对大肠杆菌等6种革兰阴性菌，对白色念珠菌等3种真菌的抑菌作用。并测定了其与NIH-3T3细胞的生物相容性，为壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的进一步应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料:壳聚糖(CS),批号20140318C(购于浙江金壳生物化学有限公司)、壳聚糖纳米银复合物(实验室自制)；硝酸银、甘油磷酸钠等均为国产分析纯、DMEM培养基(美国Gibco公司)、胰酶(美国Sigma公司)、磺酰罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)(美国Sigma公司)、细胞培养皿(美国Falcon公司)、0.22 μL滤膜(北京成萌伟业科技有限公司)、0.02 mm游标卡尺(青岛首丰精密机电有限公司)等。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、改良马丁培养基、巧克力琼脂培养基。

菌种：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的临床菌株，白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌临床菌株，以上均由聊城市中医医院提供。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，大肠杆菌标准菌株ATCC25922，铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853，流感嗜血杆菌临床菌株，以上均由聊城市人民医院提供。

细胞：NIH-3T3细胞由本实验室保存。

仪器:HH-8型恒温水浴锅(江苏金坛新航仪器厂)；Heal Force CO2培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)；TE2000S 倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；WFZUV-2100型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；MK3酶标仪(芬兰雷勃公司)等。

1.2 方法

1.2.1 温敏水凝胶的制备:实验室自制得到含纳米银0.01%、0.025%、0.05%的壳聚糖纳米银复合物，称取各样品0.2 g溶解到10 mL 0.1 mol/L的冰乙酸溶液中，充分溶解后，逐滴加入56%的甘油磷酸钠，滴加磷酸氢二钠溶液调节pH值。取溶液2 mL至离心管中，放置于37 ℃恒温水浴锅中，相转变后得水凝胶样品：A(含纳米银1×10-5的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)，B(含纳米银5×10-6的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)，C(含纳米银2×10-6的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶)。同上操作制备不含纳米银的样品D(壳聚糖温敏水凝胶)。

1.2.2 各样品对金黄色葡萄球菌(G+)临床或标准菌株的抑菌作用:将保存的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923进行活化培养，培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿上长出单菌落后，用接种环挑取少量细菌制备107cfu/mL的悬浮液。无菌条件下，在90 mm的培养皿中加适量的培养基，凝固后加100 μL菌液，涂布均匀，静置20～30 min。将制备的各温敏水凝胶样品分别用打孔器做成直径0.4 cm高0.2 cm的圆柱体，放置在固体培养基上，同一培养皿上依次放置样品A、B、C、D，重复6次，细菌在37 ℃的恒温培养箱中倒置培养24 h。观察各样品与培养基接触面有无细菌生长，并用0.02 mm游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

金黄色葡萄球菌临床菌株的抑菌作用操作同上。

1.2.3 各样品对6种G-临床或标准菌株的抑菌作用:以大肠杆菌临床菌株、大肠杆菌标准菌株ATCC25922、铜绿假单胞菌临床菌株、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853、肺炎克雷伯菌临床菌株、肺炎链球菌临床菌株、阴沟肠杆菌临床菌株及流感嗜血杆菌临床菌株为实验菌株，流感嗜血杆菌临床菌株培养基为巧克力琼脂培养基，其它菌种培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,实验方法同1.2.2。

1.2.4 各样品对3种真菌的抑菌作用：以白色念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌为实验菌株，培养基为改良马丁培养基，将保存的各菌种进行活化培养，分别配制菌液浓度为1×106cfu/mL的菌液，抑菌作用的测定方法操作同上，所用培养基为改良马丁培养基，35 ℃培养恒温培养箱中倒置培养48 h。

1.2.5 不同纳米银含量的温敏水凝胶48 h浸提液的制备：各样品水凝胶分别按照水凝胶样品:细胞培养液=0.2 g:1 mL的比例浸泡，细胞培养液为添加10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃浸泡48 h得浸提液，0.22 μm滤膜过滤除菌，DMEM培养液依次稀释，获得稀释0倍(C0)、5倍(C5)、10倍(C10)、20倍(C20)、50倍(C50)、100倍(C100)的水凝胶浸提液。

1.2.6 细胞存活率的测定：将对数生长期的NIH-3T3细胞按4000个/孔种植到96孔板，在37 ℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，细胞长到80%以上，用不同稀释倍数的浸提液处理。每组6个重复，以培养液培养为对照组，弃去细胞培养液，固定1 h，用SRB染色10 min，然后用乙酸冲洗，晾干，每孔加入100 μL Tris碱溶解，酶标仪在492 nm处测吸光值。计算细胞的相对增殖率(relative growth rate，RGR)，RGR%=(处理组A值/对照组A值)×100%。

根据美国药典中细胞毒性的六级标准评价材料的毒性大小，细胞毒性反应的分级如下：

表1 细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系

毒性的判定标准：0级和Ⅰ级判为合格，Ⅱ级者结合形态分析综合评价，Ⅲ～Ⅳ级者判为不合格。

2 结果

2.1 各样品对金黄色葡萄球菌(G+)临床或标准菌株的抑菌作用 壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶对金黄色葡萄球菌临床菌株及金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923的抑制作用结果见表2、图1。各样品对金黄色葡萄球菌均具有较好的接触抑菌作用，各样品与培养基接触面均无细菌生长。从表2中可以看出，关于对金黄色葡萄球菌临床菌株的抑菌作用，A样品、B样品、C样品与D样品相比抑菌圈直径分别增加56%、30%、15%，差异均具有统计学意义(P<0.01)。而对金黄色葡萄球菌标准菌株的抑菌作用，A样品、B样品、C样品与D样品相比抑菌圈直径分别增加51%、24%、14%，差异均具有统计学意义(P<0.01)。随着纳米银含量增加，抑菌作用增强，壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌作用优于壳聚糖温敏水凝胶。

表2 各样品对金黄色葡萄球菌(G+)临床或标准菌株的抑菌圈直径

**P<0.01，与D组比较，compared with group D

2.2 各样品对6种G-临床或标准菌株的抑菌作用 壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶对6种G-临床或标准菌株的抑菌作用结果见表3、图2。

*P<0.05，**P<0.01，与D组比较，compared with group D

图2 各样品对G-菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial activity of the samples on the gram-negative bacteria

壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶对6种革兰阴性菌均具有较好的接触抑菌作用，各样品与培养基接触面均无细菌生长。对6种革兰阴性菌的抑菌作用中，C样品对大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎链球菌临床菌株、流感嗜血杆菌临床菌株的抑菌圈直径，与D组相比差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，A、B样品抑菌作用显著强于D组(P<0.01)。壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌作用均优于壳聚糖温敏水凝胶。随着纳米银含量增加，抑菌作用增强。各样品对阴沟肠杆菌临床菌株的抑菌圈直径最大，抑菌作用最强，与其他组差异极显著(P<0.05)。

2.3 各样品对3种真菌的抑菌作用 各样品对3种真菌：白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的抑菌作用结果见表4、图3。壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶对3种真菌均具有较好的接触抑菌作用，各样品与培养基的接触面均无细菌生长。C样品与D样品对3种真菌的抑菌作用差异无统计学意义，B样品与D样品比较，对光滑念珠菌抑菌作用差异为极显著(P<0.01)，对其它2种真菌作用差异显著(P<0.05)。A样品与D样品相比，对克柔念珠菌差异显著(P<0.05)，对白色念珠菌和光滑念珠菌差异为极显著(P<0.01)。随着纳米银含量增加，抑菌圈直径明显增加，抑菌作用增强。壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌作用优于壳聚糖温敏水凝胶。对光滑念珠菌的的抑菌作用最强，对克柔念珠菌的抑菌作用明显低于其余2种真菌。

样品白色念珠菌临床菌株光滑念珠菌临床菌株克柔念珠菌临床菌株A0.648±0.008**0.693±0.008**0.574±0.0058*B0.538±0.014*0.584±0.013**0.498±0.0161*C0.482±0.0070.493±0.0160.437±0.012D(对照)0.462±0.0110.478±0.0080.428±0.008

*P<0.05，**P<0.01，与D组比较，compared with group D

图3 各样品对真菌的抑菌作用Fig.3 Antibacterial activity of the samples on the fungi

2.4 细胞相容性 水凝胶浸提液对NIH-3T3细胞增殖的影响见表5。不同稀释倍数的壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶浸提液刺激NIH-3T3细胞均没有表现出明显的细胞毒性。水凝胶浸提液稀释10倍、20倍对NIH-3T3细胞的增殖有显著的促进作用(P<0.05)。浸提液稀释0倍、5倍，细胞的相对增殖率降低，但RGR均在75%以上。不同稀释倍数的浸提液对NIH-3T3细胞的生长是有影响的，表现为较高浓度的浸提液培养细胞后，细胞的相对增殖率的降低，但这种情况还不构成对NIH-3T3细胞的毒性作用。水凝胶浸提液对NIH-3T3细胞毒性符合生物材料的安全评价标准。

表5 不同浓度的温敏水凝胶浸提液毒性测试结果(n=6)

*P<0.05，**P<0.01，与D组比较，compared with group D

3 结论

壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，对大肠杆菌等6种革兰染色阴性菌，对白色念珠菌等3种真菌均有较好的接触抑菌作用，各样品对阴沟肠杆菌临床菌株的抑制作用最强，对克柔念珠菌抑制作用最弱，对细菌的抑菌作用优于对真菌的抑菌作用。其与培养基的接触面均无细菌生长；壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶的抑菌作用优于壳聚糖温敏水凝胶，在实验范围内随着纳米银含量的增加，抑菌作用增强，纳米银增强了壳聚糖温敏水凝胶的抑菌作用。壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶具有广谱抗菌性。壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶及壳聚糖温敏水凝胶浸泡48h浸提液均没有明显的细胞毒性，有良好的细胞相容性。水凝胶浸提液稀释10倍、20倍时能明显的促进NIH-3T3细胞的增殖。 壳聚糖纳米银复合物基温敏水凝胶有较好的抑菌作用及有良好的生物相容性，作为新型创伤敷料有良好的研发应用前景。

[1] Pei L,Cai Z,Shang S,et al.Synthesis and antibacterial activity of alkylated chitosan under basic ionic liquid conditions[J].J Appl Polym Sci, 2014,131(7): 2540.

[2] 任振俶.羧基化壳聚糖改性聚氨酯的制备和表征[D].大连：大连理工大学,2012.

[3] 杨晋青.外加物理场对壳聚糖的醚化改性及其性能影响的研究[D].广州：华南理工大学,2010.

[4] Hu RX,Cheng JB,Bu DP,et al.Rare Earth-Chitosan Chelate:Functions and Applications in Animal Production[J].Chin J Anim Nutri,2013,25(8):1703-1707.

[5] 解胜利,苟建霞,丁宗旺.壳聚糖金属锌衍生物的制备及常温樱桃保鲜研究[J].湖北农业科学,2015(14):3485-3488.

[6] Rahel J,Jonasova E,Nesvorna M,et al.The toxic effect of chitosan/metal-impregnated textile to synanthropic mites[J].Pest Manag Sci,2013,69(6):722-726.

[7] 杨金艳,蒲生彦,周艳,等.壳聚糖水凝胶制备及其对Pb2+吸附性能研究[J].环境工程, 2016, 34(1):16-20.

[8] 魏坤,吴远,席云,等.复方纳米银抗菌乳液杀菌效果的研究[J].中国消毒学杂志,2010, 27(5):521-523.

[9] Gao J,Zhao C,Zhou J,et al.Plasma sprayed rutile titania-nanosilver antibacterial coatings[J].Appl Surf Sci,2015(355):593-601.

[10] Angela I,Amro E,Chitrada K,et al.Toxicity mechanisms in Escherichia coli vary for silver nanoparticles and differ from ionic silver[J].Acs Nano,2013,8(1): 374-386.

[11] 许聪.纳米银/脱细胞真皮基质的制备及抗菌性能评价[D].大连：大连医科大学,2013.

[12] 李志军,吴骁锋,郑凯,等.关于纳米银对耐药菌抑制效果研究[J].广州化工,2013, 41(12):102-104.

[13] Manish D, Seema B, Sharma VK,et al.Antibacterial Activity of Biologically Synthesized Nanosilver against Drug-Resistant Bacterial Pathogens[J].Int J Green Nanotech,2012,4(2):174-182.

(编校：王俨俨)

Antibacterial activity and cytocompatibility of chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel

LI Gao-qing, SANG QingΔ, CUI Kai

(School of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the antibacterial activity and cytocompatibility of chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel.MethodsThere were 4 groups: group A (containing 1×10-5chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group B (containing 5×10-6chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group C (containing 2×10-6chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group D (chitosan thermosensitive hydrogel ).The antibacterial activity of the samples against six kinds of gram-negative bacteria, one kind of gram-positive bacterium, three kinds of fungi were measured by bacteriostatic circle.The cytocompatibility of the extraction to NIH-3T3 cells was studied by SRB.ResultsThe antibacterial activity enhanced with the increasing of nano silver concentration in chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel, whose antibacterial activity was better than chitosan thermosensitive hydrogel; its extraction has no cytotoxicity, thus showed good cytocompatibility.ConclusionThe chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel is a potential novel wound dressing.

chitosan; nano silver; thermosensitive hydrogel; antibacterial activity; cytocompatibility

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.16

山东省科技发展计划(2014GGB01807)

李高青,女，硕士，研究方向：天然产物，E-mail：1291248398@qq.com；桑青，通信作者，女，博士，教授，研究方向：天然产物，E-mail：sangqing@lcu.edu.cn。

TB333;TB383

A