沉默中介体复合物亚基19基因对人膀胱癌细胞UM-UC3迁移能力的影响

门昌平，高振利，吴吉涛，袁贺佳，杨典东，于胜强，王永强，鲁友谊

(青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院泌尿外科，山东烟台　 264000)



·基础研究·

沉默中介体复合物亚基19基因对人膀胱癌细胞UM-UC3迁移能力的影响

门昌平，高振利，吴吉涛，袁贺佳，杨典东，于胜强，王永强，鲁友谊

(青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院泌尿外科，山东烟台 264000)

摘要：目的探讨中介体复合物亚基19(Med19)对人膀胱癌UM-UC3细胞迁移能力的影响及其机制。 方法采用针对Med19的siRNA慢病毒载体转染人膀胱癌UM-UC3，应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹方法(Western blot)检测Med19-siRNA转染组(siRNA)与空载组(NC)Medl9基因表达情况；采用Western blot检测细胞外基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达；采用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。 结果Medl9-siRNA慢病毒感染UM-UC3细胞后，转染组Medl9 mRNA表达与空载组相比明显降低，差异有统计学意义(t=10.15，P<0.01)，且转染组Med19、MMP-2和MMP-9蛋白表达明显降低，差异有统计学意义 (t值分别为71.36，26.34，8.627，均P<0.01)，划痕实验和Transwell实验显示转染组细胞迁移能力明显减弱。 结论沉默Med19基因可通过抑制MMP-2和MMP-9的表达降低人膀胱癌细胞UM-UC3的迁移能力。

关键词：Med19； 慢病毒； RNA干扰； 膀胱癌； 迁移

Med19是中介体复合物(Mediator)的重要组成部分，对于Mediator与RNA聚合酶Ⅱ的结合与活化有着重要作用。在Med19表达被抑制的情况下，Mediator与RNA聚合酶Ⅱ的亲和力降低。Med19作为转录活化基因，对肿瘤的发生、发展具有重要作用，且与胃癌、肝细胞肿瘤、乳腺癌和前列腺癌的发展关系密切[1-2]。为进一步了解Med19对膀胱癌细胞迁移能力的影响，我们采用慢病毒转染的方法抑制人膀胱癌细胞UM-UC3中 Med19的表达，观察细胞迁移能力的变化，并探讨其分子机制。

1资料与方法

1.1材料人膀胱癌UM-UC3细胞株购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，UM-UC3细胞培养在含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，培养条件设定为5% CO2，37 ℃。qRT-PCR相关试剂购自日本TaKaRa公司。兔抗人Med19多克隆抗体、鼠抗人MMP-2单克隆抗体和鼠抗人MMP-9单克隆抗体购自美国Sigma公司。针对Med19的siRNA慢病毒载体及qRT-PCR引物均由上海吉凯基因有限公司合成。

1.2方法

1.2.1慢病毒转染细胞置于六孔板中培养，当细胞生长到六孔板面积的20%时分别采用Med19-siRNA病毒与空载病毒转染膀胱癌细胞，72 h后收集细胞用于mRNA和蛋白的检测。

1.2.2qRT-PCR检测Med19 mRNA表达水平Trizol法提取细胞总mRNA，采用qRT-PCR方法检测Med19 mRNA表达。Med19引物序列：上游5′-TGCCAGGGATGATTGATCTG-3′，下游5′-TCTTCTTGGGAGGCTGAATATG-3′。β-actin作为内参照，上游5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.2.3Western blot检验Med19、MMP-2、MMP-9蛋白表达每孔上样量为30 μg蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)凝胶电泳分离，将蛋白质电转至醋酸纤维(NC)膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1 h，用化学底物发光液(Electro-Chemi-Luminescence，ECL)暗室显影。

1.2.4划痕实验将悬浮细胞接种至六孔板中，生长至六孔板面积的80%时用1 mL的枪头在培养皿中制造“一”字行划痕，用含有5%胎牛血清培养24 h，观察划痕区细胞迁移。

1.2.5Transwell实验细胞接种于上层Transwell小室，上室加入无血清RPMI 1640无血清培养基，下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养24 h后取出小室进行细胞固定，用MTT染色，显微镜下随机选取3个视野，并使用Image J(v2.1)计算细胞穿膜数。

2结果

2.1慢病毒转染膀胱癌细胞后Med19 mRNA水平的表达病毒转染细胞72 h后转染组的Med19 mRNA表达较空载组明显降低(t=10.15，P<0.01)。

2.2慢病毒转染膀胱癌细胞后Med19、MMP-2、MMP-9蛋白水平的表达转染72 h后提取细胞总蛋白，Western blot结果显示转染组Med19蛋白表达被抑制(t=71.36，P<0.01)；同样，MMP-2(t=26.34，P<0.01)与MMP-9(t=8.627，P<0.01)蛋白表达也被抑制(图1)。

图1Western blot检测转染前后Med19、MMP-2、MMP-9蛋白水平变化

转染组Med19、MMP-2、MMP-9的表达同空载组相比显著降低。

2.3划痕实验结果空载组划痕两侧的细胞向空白区域大量迁移，而转染组向空白区域迁移的细胞数明显减少，提示细胞迁移能力被明显抑制(图2)。

图2　划痕实验检测细胞迁移能力

A、B分别为空载组0 h、24 h划痕边缘变化情况；C、D分别为转染组0 h、24 h划痕边缘变化情况。同空载组相比，转染组细胞迁移能力明显减弱。虚线处为划痕边缘;×200。

2.4Transwell实验对照组小室下表面附着细胞数为(126.0±6.08)个/cm2，较转染组(43.67±5.8)个/cm2明显增多，差异有统计学意义(P<0.01,图3)。

图3　Transwell实验检测细胞迁移能力

A、B分别为空载组、转染组24后细胞迁移情况，同空载组相比，转染组穿过小室的细胞数明显减少;×200。

3讨论

中国属于膀胱癌死亡水平较低的国家之一，但近5年间的死亡率呈现逐年增长趋势[3]，其发生发展呈多因素、多步骤的复杂变化过程，可能与吸烟、职业暴露、免疫因素等相关[4-5]，但发病机制尚待明确。Mediator在基因转录过程中处于核心位置，含有不同激酶组件的Mediator复合物可对多种类型的基因起到调节作用。Mediator复合物能刺激基础转录，维持激活的转录，同时刺激RNA聚合酶Ⅱ末端结构域(CTD)的磷酸化，磷酸化的RNA聚合酶II末端结构域参与染色质重组，并作为一个支架蛋白招募组蛋白修饰的酶至基因转录区域[6]。

Med19作为Mediator家族的重要成员，在基因转录过程中发挥重要功能，与细胞的生长和周期调控关系紧密，可通过介导多种信号途径影响细胞生长。单纯去掉Med19亚基使Mediator复合物的稳定性降低，并削弱Mediator同RNA聚合酶II的结合能力，因而阻碍RNA聚合酶II的CTD磷酸化，导致基础转录降低。Med19作为肿瘤转移相关基因，参与肿瘤细胞的生长、浸润和转移，在许多恶性肿瘤组织髙表达，而在正常组织或良性病变低表达或不表达[1]。CUI等[7]发现，沉默前列腺癌细胞中Med19的表达可以使前列腺癌细胞停留在细胞周期S期，并且转染后的前列腺癌细胞凋亡的水平明显增加；CHEN等[8]研究表明其Med19在非小细胞肺癌中表达升髙，并与临床分期正相关；DING和SUN等[9-10]在研究Med-19与胃癌的关系时发现，采用慢病毒沉默胃癌细胞中Med19的表达可以显著削弱胃癌细胞的增殖和克隆形成能力，导致胃癌细胞停留在细胞周期G1期。LI等[11]发现Med19在乳腺癌中也起到了类似作用[12]。

本研究通过慢病毒转染的方法沉默人膀胱癌细胞UM-UC3细胞Med19的表达，探究Med19对膀胱癌细胞迁移能力的影响及及机制。结果显示，采用Med19-siRNA慢病毒转染UM-UC3细胞后成功抑制了Med19 mRNA和蛋白的表达，同时MMP-2和MMP-9蛋白的表达也受到削弱。MMP-2和MMP-9与细胞的迁移与转移密切相关，可通过降解细胞外机制促进细胞的迁移和转移，因此，我们进一步用划痕实验和Transwell实验检测UM-UC3细胞的迁移能力，结果显示肿瘤细胞的迁移能力被明显抑制，提示Med19可能是膀胱癌的一个新的抑癌基因，可能通过抑制MMP-2和MMP-9的表达抑制膀胱癌的迁移和转移。

在膀胱癌治疗中，以Medl9基因为靶点，利用慢病毒转染靶向RNA干扰技术进行基因治疗有可能成为一种新的有前景的方法，为膀胱癌的分子生物治疗提供新的思路。

参考文献：

[1] SCHIANO C, CASAMASSIMI A, RIENZO M, et al.Involvement of Mediator complex in malignancy [J].Biochim Biophys Acta, 2014, 1845(1): 66-83.

[2] SPAETH JM, KIM NH, BOYER TG.Mediator and human disease [J].Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(7): 776-787.

[3] 韩苏军, 张思维, 陈万青, 等.中国膀胱癌死亡现状及流行趋势分析 [J].现代泌尿外科杂志, 2013, 03(18): 228-232.

[4] 白云金, 李金洪, 魏强.膀胱癌病因学研究进展 [J].现代泌尿外科杂志, 2014, 10(19): 693-697.

[5] 胡吉梦, 姜昊文.免疫相关因素在膀胱癌发病机制与免疫治疗中的研究进展 [J].现代泌尿外科杂志, 2015, 07(20): 520-524.

[6] CONAWAY RC, CONAWAY JW.Function and regulation of the Mediator complex[J].Curr Opin Genet Dev, 2011, 21(2): 225-230.

[7] CUI X, XU D, LÜ C, et al.Suppression of MED19 expression by shRNA induces inhibition of cell proliferation and tumorigenesis in human prostate cancer cells [J].BMB Reports, 2011, 44(8): 547-552.

[8] CHEN L, LIANG Z, TIAN Q, et al.Overexpression of LCMR1 is significantly associated with clinical stage in human NSCLC [J].J Exp Clin Cancer Res, 2011, 30(18).

[9] DING XF, HUANG GM, SHI Y, et al.Med19 promotes gastric cancer progression and cellular growth [J].Gene, 2012, 504(2): 262-267.

[10] SUN M, JIANG R, LI JD, et al.MED19 promotes proliferation and tumorigenesis of lung cancer [J].Mol Cell Biochem, 2011, 355(1-2): 27-33.

[11] LI LH, HE J, HUA D, et al.Lentivirus-mediated inhibition of Med19 suppresses growth of breast cancer cells in vitro [J].Cancer Chemother Pharmacol, 2011, 68(1): 207-215.

[12] ZOU SW, AI KX, WANG ZG, et al.The role of Med19 in the proliferation and tumorigenesis of human hepatocellular carcinoma cells [J].Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(3): 354-360.

(编辑何宏灵)

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收稿日期：2015-12-03修回日期：2016-01-14

基金项目:山东省自然科学基金英才基金资助项目(No.ZR2015 HM021)

通讯作者:高振利，教授.E-mail: gzlurology @163.com

作者简介:门昌平(1976-)，男(汉族)，在读硕士，主治，研究方向为泌尿生殖系统肿瘤.E-mail：mchp001@163.com

中图分类号:R34

文献标志码:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.02.019

Lentivirus-mediated inhibition of Med19 suppresses migration of bladder cancer UM-UC3 cells

MEN Chang-ping, GAO Zhen-li, WU Ji-tao, YUAN He-jia, YANG Dian-dong, YU Sheng-qiang, WANG Yong-qiang, LU You-yi

(Department of Urology, Yantai Yuhuangding Hospital Affiliated to Medical College of Qingdao University, Yantai 264000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the effect of lentivirus-mediated inhibition of Med19 on the migration of human bladder cancer UM-UC3 cells, and to explore its potential mechanism.MethodsThe lentivirus vectors containing small interfering RNA(siRNA) targeting Medl9 gene were constructed and transfected to human bladder cancer UM-UC3 cells.Quantitative real-time PCR(qRT-PCR) and Western blot analysis were used to detect the Medl9 expression in the siRNA group(Lv-Med19siRNA cells) and the NC group(Lv-NC-infected cells) 72 h after the transfection.Western blot was used to examine the changes of expression in matrix metalloproteinase 2(MMP-2) and MMP-9.The influence of Medl9 on the migration of bladder cancer cell was assessed with wound healing assay and transwell assay.Results The expressions of MMP-2 and MMP-9 were greatly reduced 72 h after Med19 inhibition(t value was 26.34 and 8.627,P<0.01), and the migration ability was remarkably inhibited in the siRNA group.ConclusionMed19 inhibition reduces migration ability of human bladder cancer UM-UC3 cells via down-regulating MMP-2 and MMP-9 expressions.

KEY WORDS:Med19; bladder cancer; migration