干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠黏膜结构及上皮内淋巴细胞数量的影响

王齐桓,王安如,周宁聪,张魏伟,苏华荔,汤林杰,马云飞,滕可导(.中国农业大学动物医学院,北京海淀009;.北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室,北京海淀009;.内蒙古乌兰察布市畜牧科学研究所,内蒙古乌兰察布0000)

干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠黏膜结构及上皮内淋巴细胞数量的影响

王齐桓1,王安如2,周宁聪3,张魏伟1,苏华荔2,汤林杰1,马云飞1,滕可导1
(1.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;2.北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室,北京海淀100192;3.内蒙古乌兰察布市畜牧科学研究所,内蒙古乌兰察布012000)

为了探究干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠黏膜组织发育及免疫功能的影响,将96头14日龄断奶仔猪随机分为空白对照组、乳杆菌对照组、K88攻毒组、预防组,每组4个重复,采用组织化学和免疫组织化学方法观察回肠黏膜组织结构及上皮内淋巴细胞数量的变化.结果显示,饲用干酪乳杆菌进行预防能够显著提高断奶仔猪回肠绒毛高度、V/C值,增加PCNA含量,提高肠上皮内淋巴细胞数量.表明干酪乳杆菌能保护肠道组织,提高肠道免疫力,降低大肠杆菌对肠道的损害.

断奶仔猪;乳杆菌;绒毛;淋巴细胞

Corresponding authors:TENG Ke-dao;MA Yun-fei

早期断奶仔猪常出现"早期断奶综合征",导致其肠道功能紊乱,腹泻率增加[1],极大影响养猪业的经济效益.益生菌作为一种活的微生物,对肠道黏膜有保护作用,可以治疗各种肠道疾病,有研究[2-3]表明,益生菌在肠道结构及黏膜免疫作用中发挥重要功效,我们研究的益生菌是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang,Lc Zhang),其功能主要表现在调节肠道内菌群平衡、促进消化吸收,产生抗体免疫等作用[4-5].回肠是小肠的末段,在肠道免疫中起重要作用,肠上皮细胞是仔猪抵抗饲料毒素及外来致病菌的重要防线,其包含具有一定免疫功能的淋巴细胞,肠绒毛的上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)数量一定程度反映肠道对抗外来刺激能力[6].本试验采用组织学及免疫组织化学方法,探究经口饲喂干酪乳杆菌对回肠黏膜结构及上皮内淋巴细胞数量的影响,旨在为干酪乳杆菌作为仔猪生产中一种新型饲料添加剂的应用提供理论依据.

1　材料与方法

1.1试验设计及样品采集干酪乳杆菌Lactobacil⁃lus casei Zhang(Lc Zhang)和大肠杆菌K88(O149∶K91,K88ac均由大北农饲用微生物国家重点实验室提供,分别作为益生菌和致病菌模式菌株,选取14日龄断奶仔猪96头(杜、长、大三元杂交猪,由广东瑞昌食品进出口有限公司致富猪场提供),随机分成4组,每组4个重复,每个重复6头猪.分组如下:(1)空白对照组:14日龄断奶仔猪,基础日粮正常饲养4周;(2)乳杆菌对照组:在日粮中添加干酪乳杆菌(剂量为107CFU/g),持续饲喂Lc Zhang 4周;(3)攻毒组:正常饲喂2周后(即28日龄),大肠杆菌K88配制成悬液进行灌胃攻毒(剂量为1010CFU/头),然后正常饲养2周; (4)预防组:饲喂Lc Zhang 2周后,攻毒并停喂Lc Zhang 2周,剂量同上.仔猪饲养至42日龄,每组随机选取4头仔猪,腋下动脉放血致死,剖开腹腔,取回肠组织置于多聚甲醛固定.

1.2石蜡切片的制作及H.E.染色将固定好的组织块进行常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋,制备4 μm厚的连续切片.切片常规脱蜡,苏木精染色15 min,1%盐酸-酒精溶液分色后,自来水蓝化15 min;梯度酒精逐级脱水;浸入伊红染液1.5 min;常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. Nikon Ni-U显微镜观察.

1.3PCNA免疫组织化学染色切片常规脱蜡至蒸馏水,3%H2O2室温孵育10 min,抗原修复10 min,滴加1∶200小鼠抗PCNA单克隆抗体(BM 0104,武汉博士德生物工程有限公司)4℃过夜;滴加生物素化的山羊抗小鼠的IgG(SP 9002,北京市中杉金桥生物技术有限公司),室温孵育30 min;滴加HRP标记的链霉卵白素复合物(SP 9002,北京市中杉金桥生物技术有限公司),室温孵育30 min;DAB显色5 min;苏木精复染30 s,常规脱水、透明、中性树胶封片.各步骤之间均用PBS(pH值7.3)冲洗3次,每次5 min.

1.4数据统计及分析利用IPP 6.0软件统计肠绒毛高度、肠隐窝深度、每100个柱状上皮细胞间的淋巴细胞数量及肠腺中PCNA阳性物质的平均光密度值.采用SPSS 17.0软件One-Way ANOVA模块进行统计分析,结果用"平均数±标准差"表示.P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异显著.

2　结果与分析

2.1干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠绒毛高度、肠隐窝深度及V/C比值的影响与A组的绒毛高度、V/C比值相比,B组分别提高6.38%、5.40%,差异均显著(P<0.05);C组分别降低19.66%、14.13%,差异均极显著(P<0.01).与C组相比,D组的绒毛高度、V/C比值分别提高15.95%、9.81%,差异均极显著(P<0.01).回肠中各组间的隐窝深度没有显著差异(P>0.05).见图1.

图1　干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠绒毛高度、肠隐窝深度、V/C比值的影响

2.2干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠PCNA表达的影响免疫组织化学染色结果显示,与A组的PCNA表达量相比,B组增加了18.21%,差异显著(P< 0.05);C组降低了39.27%,差异极显著(P<0.01).与C组相比,D组PCNA的表达量增加了72.87%,差异极显著(P<0.01).见中插彩版图2、3(a).

2.3干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠上皮内淋巴细胞数量的影响与A组的IEL数量相比,B组增加了16.24%,差异显著(P<0.01);C组降低了8.10%,差异极显著(P<0.05).与C组相比,D组的IEL数量增加了34.86%,差异显著(P<0.01).见图3 (b).

3　讨论

3.1干酪乳杆菌对仔猪回肠组织发育的影响小肠绒毛是吸收营养物质的重要部位,成熟的绒毛细胞具有吸收养分的功能,绒毛高度增加表明吸收养分的表面积增加[7].绒毛隐窝被认为是绒毛工厂,肠上皮细胞起源于隐窝,沿着绒毛表面向上迁移至绒毛尖端并伸入肠腔[8].营养生理学的研究表明,绒毛高度与隐窝深度的比值(绒腺比)能表示小肠上皮细胞更新代谢程度[9].郭元晟等[10]研究表明,饲喂发酵乳杆菌能够显著提高鸡小肠各段绒毛高度、V/C比值,改善小肠的黏膜结构.邓军等[11]研究发现,饲喂枯草芽孢杆菌、猪源乳酸杆菌可以显著提高仔猪回肠的绒毛高度和V/C的比值,降低回肠隐窝的深度.我们的试验结果表明,与空白对照组相比,乳杆菌对照组的回肠绒毛高度显著增加.预防组的仔猪回肠绒毛高度也显著高于K88攻毒组,说明干酪乳杆菌能有效的抵御大肠杆菌对肠道黏膜组织结构的破坏,保护绒毛的完整性,对仔猪的生长发育起到一定保护作用.饲用干酪乳杆菌对回肠的肠隐窝深度没有显著的影响.与空白对照组相比,乳杆菌对照组的回肠V/C值显著增加.预防组的仔猪回肠V/C值显著高于K88攻毒组,说明饲用干酪乳杆菌能有效的保护肠道黏膜组织的形态结构和功能.

图3　干酪乳杆菌对断奶仔猪回肠PCNA表达及上皮细胞内淋巴细胞的影响

增殖细胞核抗原(PCNA)是细胞增殖的重要标记物,通常使用免疫组化来评估细胞增殖[12].我们的试验结果表明,与空白对照组相比,乳杆菌对照组的回肠PCNA的表达量显著增加.预防组的仔猪回肠PCNA的表达量显著高于K88攻毒组.说明干酪乳杆菌能有效地保护肠道黏膜不受致病菌的侵袭,维持肠道的稳态.

3.2干酪乳杆菌对仔猪肠上皮内淋巴细胞的影响小肠上皮内淋巴细胞作为肠道黏膜免疫相关细胞的重要组成部分,在抗感染、调节上皮细胞的完整性和外来抗原的免疫应答方面起重要作用,其数量的变化在一定程度上反映消化道的局部免疫状况[13].Kim等[14]报道,在小鼠口服大肠杆菌后,CD8αα+IEL明显减少,肠上皮细胞分泌的细胞因子分泌减少和受体表达下降,导致肠上皮细胞凋亡增多,加重黏膜的破坏.我们的试验结果表明,与空白对照组相比,乳杆菌对照组的IEL数量显著提高.预防组IEL数量显著高于K88攻毒组.说明饲用干酪乳杆菌能显著提高肠道免疫力,抵抗病原菌入侵,保护机体健康.

综上所述,饲喂干酪乳杆菌能够有效地提高两周龄断奶仔猪回肠的绒毛高度、V/C比值,说明干酪乳杆菌能保护肠道结构,降低大肠杆菌对肠道的损害.饲喂干酪乳杆菌能够在一定程度上提高断奶仔猪肠道上皮内淋巴细胞数量,增强肠道免疫力与抗病原体侵袭的能力.本研究将为益生菌广泛应用于生产实践提供一定的理论和实验依据.

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Effect of Lactobacillus casei on mucosal structure and number of intraepithelial lym phocyte of ileum in weaned piglets

WANG Qi-huan1,WANG An-ru2,ZHOU Ning-cong3,ZHANG Wei-wei1, SU Hua-li2,TANG Lin-jie1,MA Yun-fei1,TENG Ke-dao1
(1.College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China;2.State Key Laboratory of Direct-Fed Microbial Engineering,Beijing DaBeiNong Science and Technology Group Co.,Ltd.(DBN),Beijing 100192,China;3.Ulanqab City Institute of Animal Husbandry Sciences,Inner Mongolia,Ulanqab 012000,China)

To explore the effect of lactobacillus casei on the development and immune function of ileum in weaned piglets, ninety-six 14-day-old weaned piglets were divided into four groups,and the ileum mucosal structure and the number of intraepi⁃thelial lymphocyte were examined by histochemistry and immunohistochemistry.The results showed that the lactobacillus casei group compared with the other groups appeared complete structural morphology,and aligned epithelial cell.Feeding Lactobacillus casei for prevention significantly improved the height of intestinal villus and the ratio of V/C,significantly increased PCNA content, and promote the quantity of lymphocyte between intestinal villus in weaned pig.These results suggest that,Lactobacillus casei in food could obviously protect intestinal tissue,improve intestinal immunity,and reduce the damage of intestinal E.coli.

Weaned piglets;lactobacillus casei;villus;lymphocyte

S858.28

A

0529-6005(2016)02-0034-03

2015-04-28

北京大北农科技集团股份有限公司饲用微生物工程国家重点实验室开放课题(201205410511191);国家973计划项目(2012CB723702)

王齐桓(1990-),男,硕士生,研究方向为基础兽医学,E-mail:wqihuan@cau.edu.cn

滕可导,E-mail:kedao@cau.edu.cn;马云飞,E-mail: yunfeima@cau.edu.cn