黄连等对假丝酵母菌的体外抑菌研究

吴　亚,刘东梅,郄会卿,杨翠娥

(1.河北省中医院,河北 石家庄050011;2.宁晋县中西医结合医院,河北 宁晋县055550)



黄连等对假丝酵母菌的体外抑菌研究

吴亚1,刘东梅1,郄会卿1,杨翠娥2

(1.河北省中医院,河北 石家庄050011;2.宁晋县中西医结合医院,河北 宁晋县055550)

随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂以及侵入性诊断治疗普遍应用，深部真菌感染的发病率日益增加，我院假丝酵母菌分离率居所有感染菌的第五位。但目前临床上应用的西药抗真菌药物，存在毒性大、费用高、耐药性增加等缺点。不少学者致力于中药的抗细菌、抗真菌方面的研究，笔者对黄连、茵陈、黄芪进行了体外抑菌试验，寻求中药在抗真菌感染方面的功效，旨在能更好的服务和指导临床用药。

1　材料

1.1菌株

2013年3月至2014年3月河北省中医院微生物室分离的假丝酵母菌104株，其中白假丝酵母菌48株，热带假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌各20株，近平滑假丝酵母菌12株，葡萄牙假丝酵母菌4株，菌株分别来自患者的血液、中段尿和痰液标本。

1.2培养基

①RPMI1640液体培养基：将RPMI1640粉末20.8 g，葡萄糖40 g，用0.33M三吗琳基丙磺酸(MOPS)缓冲液溶解，同时用1M NaOH调整PH值至6.9-7.1，最后定容至1L，过滤除菌备用。②4%琼脂 将40 g琼脂溶于1 000 ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，备用。

1.3药液储存液制备

取各中药材100 g，加适量蒸馏水浸泡30 min,强火加热煮沸，再以文火煎煮30 min，纱布过滤，滤渣再加适量蒸馏水煎煮30 min，过滤弃渣，合并滤液，加热浓缩到0.1 L，即相当于原生药1 000 g/L。121℃高压灭菌20 min，-20℃冰箱保存备用。

1.4主要仪器和试剂

①高压蒸汽消毒锅：日本三洋株式会社；②电热恒温培养箱：南京建成仪器有限公司；③比浊仪：法国梅里埃生物制品公司；④MIT-P多点接种仪：日本佐久间制作所；⑤沙保罗平板、琼脂粉、葡萄糖均购自杭州天和微生物试剂有限公司；⑥ RPMI1640粉：美国Life Technologies Inc产品；⑦MOPS粉：Fluka公司产品； ⑧黄连、茵陈、黄芪：均购于河北省药材公司。

2　方法

采用琼脂稀释法，对黄连、茵陈、黄芪进行定量抑菌试验。

2.1药物平板制备

将RPMI1640液体培养基与4%琼脂于60℃ 1∶1混匀，分装入试管中，每管分装18 ml,仍置60℃保温。将倍比稀释后的不同浓度的中药液2 ml加于试管中，轻轻振摇混匀，倒入直径90 mm平皿，置水平桌面使之凝固，最终配制成含中药浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 g/L的药物平板，并设不含中药的琼脂平板为生长对照，不接种菌液且不含中药的琼脂平板做空白对照。

2.2菌悬液制备

将104株受试菌和质控菌株(白假丝酵母菌90028)在沙保罗平板连续传代培养2次，以确保菌落的纯化和活力，第2次35℃传代培养48 h后取培养菌落用无菌生理盐水分别配制成0.5麦氏比浊的菌悬液。

2.3培养与观察

用MIT-P多点接种仪将配制好的0.5麦氏比浊菌悬液10 μl接种于含不同中药浓度的药物平板和生长对照平板上，于35℃培养48 h，如果生长对照平板假丝酵母菌全部生长且空白对照平板无假丝酵母菌和杂菌生长，则观察含中药各药物平板的最低抑菌浓度(MIC)，并统计出MIC50和 MIC90的药物浓度和累积抑菌百分率。

3　结果

3.1黄连、茵陈和黄芪对假丝酵母菌的抑菌作用

通过对104株假丝酵母菌进行体外抑菌试验，结果表明黄连的抑菌效果很好，MIC范围在0.39 g/L-25.00 g/L之间，MIC50和 MIC90分别为1.56 g/L和6.25 g/L，茵陈的抑菌效果最差。结果见表1。

3.2黄连、茵陈和黄芪对各种假丝酵母菌的抑菌作用

黄连对热带假丝酵母菌的抑菌效果最好，MIC范围在0.39 g/L-1.56 g/L之间，其次为光滑假丝酵母菌(0.78 g/L-3.12 g/L)、白假丝酵母菌(0.78 g/L-3.12 g/L)和葡萄牙假丝酵母菌(3.12 g/L-6.25 g/L)，对近平滑假丝酵母菌(6.25 g/L-25.00 g/L)也有一定的抑菌作用。黄芪仅对热带假丝酵母菌有一定抑制作用。未检出茵陈的抑菌作用。结果见表2。

4　讨论

近年来随着抗生素、激素、免疫抑制剂等药物以及介入治疗的广泛应用，临床上真菌感染的比例大大增加，对抗真菌药物的耐药问题也越来越突出。本试验为了寻求单味中药在抑制真菌方面的功效，采用琼脂稀释法对104株临床分离的假丝酵母菌菌株进行了体外抑菌试验。琼脂稀释法有很多优点，可同时测定多个菌株，易于确定终点，比液体稀释法重复性好[1]。宋波[2]等曾采用琼脂稀释法对苦参、黄芩、乌梅对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌进行定量抗菌实验，检出乌梅对白假丝酵母菌抑菌作用较好。

表1　黄连等对104株假丝酵母菌的累积抑菌率比较(%)

注：*MIC50所在药物琼脂平板的中药浓度；△MIC90所在药物琼脂平板的中药浓度。

表2　黄连等对各种假丝酵母菌的MIC范围(g/L)

本研究通过琼脂稀释法体外抑菌试验发现，黄连对假丝酵母菌具有较强的体外抑菌作用，其MIC范围在0.39 g/L-25.00 g/L之间，MIC50 和MIC90分别为1.56 g/L和6.25 g/L。对热带假丝酵母菌抑菌作用最强，MIC范围在0.39 g/L-1.56 g/L之间，对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和葡萄牙假丝酵母菌次之，对近平滑假丝酵母菌也有较强的抑菌作用。其中对白假丝酵母菌的MIC范围在0.78 g/L-3.12 g/L，其比王文花等[3]报道黄连提取液对白色念珠菌具有较强的体外抑菌效果，其 MIC 为6.25 g/L还要低。和刘涛峰等[4]报道黄连对白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等的标准菌株均有较强的抑菌作用一致。黄连主含小檗碱(黄连素)，含量高达50%，小檗碱对白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌的生长均具抑制作用[5]。水提黄连与醇提黄连对白念珠菌都有较强的抑菌作用[6];黄芪能使血液中白细胞显着增加，网状内皮系统的吞噬功能增强，从而使机体非特异性抵抗力增加。黄芪能促进抗体合成，对体液免疫有促进作用，还有诱生干扰素的作用，使其免疫功能增强[7]。本试验中发现黄芪仅对热带假丝酵母菌有一定的抑菌作用，对其它假丝酵母菌未发现有抑菌作用[8]；未检出茵陈对假丝酵母菌有抑制作用，这与某些研究[9]报道茵陈的挥发油茵陈炔酮在试管内能抑制皮肤病原性真菌的生长结果不一致，这可能与中药的提取方式有关。本试验用的是水煎剂，有些具有抑制真菌作用的成分可能不溶于水，或者煎煮时不耐受高温而被破坏或挥发，影响了抑菌效果，这些有待于进一步研究和改进。总之，中药在抑制真菌方面的作用前景可观，除小檗碱抗真菌作用较强外，也有报导黄芩苷、苦参碱等中药成分抗真菌能力也很强[10]，这些提纯后的中药成分有待于通过大量动物试验和临床研究来拓展中药抗真菌的这一功效。

[1]周宁,张建新,樊明涛,等.细菌药物敏感性实验方法研究进展[J].食品工业科技,2012,33(9):459.

[2]宋波,刘颋,吕丽艳,等.苦参、黄芩、乌梅对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌抗菌活性的研究[J].中国微生态学杂志,2010,(22)6:507.

[3]王文花,李劲松,肖晴晴,等.5 种中药体外抗白色念珠菌的实验研究[J].广西中医学院学报,2010,13(3):54.

[4]刘涛峰,郑玉荣,刘小平,等.10种中药水煎剂对念珠菌的体外抑菌作用[J].安徽中医学院学报,2012,21(4):72.

[5]周笑梅,宁玉梅.单味中药抑制白假丝酵母菌作用的研究进展[J].中华中医药学刊,2011,29(3):580.

[6]王玲,吕雪莲,孙令,等.中药提取物对酵母菌抗真菌活性研究[J].中国真菌学杂志,2009,4(1):16.

[7]辛洪涛,侯林江,徐少华,等.玉屏风散的免疫药理研究进展[J].中国中药杂志,1998,23(8):57.

[8]于军.中药抗真菌的实验研究[D].吉林大学,2007.

[9]董岩,王新芳,崔长军,等.茵陈蒿的化学成分和药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(4):874.

[10]郑玉荣,刘涛峰,张虹亚,等.中药成分抗白念珠菌的实验研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2011,10(6):399.

河北省中医药管理局科研计划项目(编号2013048)

1007-4287(2016)08-1276-02

吴亚(1975-)，女，硕士学位，副主任技师，主要从事临床微生物检验研究。

2015-07-21)