中药水提物对体外猪链球菌生物被膜作用的试验

陈俭清 ， 周永辉 ， 杨艳北 ， 白靖文 ， 李艳华

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

中药水提物对体外猪链球菌生物被膜作用的试验

陈俭清 ， 周永辉 ， 杨艳北 ， 白靖文 ， 李艳华

(东北农业大学动物医学学院 ， 黑龙江哈尔滨150030)

猪链球菌耐药性与生物被膜的形成有关，本试验选取常用的20味清热解毒的中药，采用微量稀释法测定20味中药水提物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，采用卡尔加里生物被膜装置和平板稀释法测定20味中药在亚MIC(1/2MIC)药物浓度下对生物被膜的干预作用，结果表明：丁香叶、金银花、黄芩、穿心莲、黄柏和鱼腥草等中药水提物干预生物被膜效果显著(P<0.05)大黄、黄连水提物干预生物被膜效果极显著(P<0.01)，通过细菌计数发现，0～72h，1/2MIC中药提取物对猪链球菌数量影，响不显著(P>0.05)。丁香叶、大黄和黄连水提物对生物被膜中的猪链球菌具有很好的杀灭作用(P<0.05)。

中药；生物被膜；猪链球菌；体外

猪链球菌是一种世界范围的人兽共患病病原菌。能引起猪只的败血症、脑膜炎、关节炎和心内膜炎。生物被膜是细菌产生的多聚复合物基质，并将自身包绕，粘附于无活性物体或活体表面。生物被膜菌的耐药性远远高于浮游态细菌。故在兽医临床急需安全有效并且廉价、不易产生耐药性的治疗方案。本试验通过中药水提物体外对生物被膜作用的研究，为筛选中药和开发中药提供新思路[1-2]。

1 材料与方法

1.1 中药提取物的制备连翘、丁香叶、金银花、柴胡、大黄、黄连、穿心莲、鱼腥草、黄柏、紫菀、大青叶、板蓝根、诃子、荆芥、千里光、野菊花，购自中国药材集团黑龙江省药材公司。经鉴别为道地药材。称取中药各200 g 于烧杯中，粉碎(过2号筛不过3 号筛)，加蒸馏水2 L，室温浸泡过夜。大火煮开后再用文火煎煮45 min，倒出药液，过滤，再加入蒸馏水1.5 L 煎煮30 min，过滤。将两次药液混合，加热浓缩为100 mL，滤液经冻干机冻干。准确称量中草药冻干粉末各1.0005 g，用4mL ddH2O溶解，离心取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，保存在4 ℃备用。

1.2 菌株 野生型猪链球菌由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所馈赠，经鉴定为猪链球菌。

1.3 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

试验操作及结果判定参照临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准微量稀释法[4]。

1.4 猪链球菌生物被膜模型建立 将猪链球菌菌株接种于THB 琼脂平板，3 7℃培养过夜。取单个菌落接种于THB 培养基中，37 ℃培养12 h～16 h。将浊度为0.5 麦氏单位的菌液稀释为约1.0×105CFU/mL，取200 μL 接种于卡尔加里生物被膜装置中，设置空白对照组，混匀后盖好，37 ℃，50 r/min摇床上孵育72 h。取出卡尔加里生物被膜装置(MBEC BiofilmTechnologies，Calgary，Alberta)，用移液器弃去培养基，并用灭菌的PBS(pH 值7.2)轻轻洗涤3 次以去除游离菌。将仍然附着在卡尔加里生物被膜装置上的被膜菌用200μL 甲醇固定30 min。弃去固定液待自然风干后，室温下用200 μL 0.1%结晶紫对生物被膜染色30min。染色完毕，弃去染色液，用PBS(pH 值7.2)清洗两次以去除游离的染色液，风干，然后每孔加入200 μL 浓度为33%的冰乙酸溶液，置于振荡器10 min 以释放生物被膜中的结晶紫。酶标仪595 nm处测定OD 值。

1.5 中药水提物(浓度1/2MIC)对猪链球菌生物被膜的干预作用 将浊度为0.5 麦氏单位的菌液稀释到1.0×105CFU/mL，向卡尔加里生物被膜装置每孔中和中药提取物共200 μL(浓度1/2MIC)，另设空白对照孔，阴性对照孔和阳性对照孔，每个样品5 个重复。37 ℃，50 r/min 摇床上孵育72 h，PBS 清洗2 次，固定，染色，测定OD595值。

1.6 中药提取物(浓度1/2MIC)对猪链球菌生长的影响 通过2.5 的筛选，将具有干预作用的中药水提物，配制成浓度为1/2MIC，菌液浓度为1.0×105CFU/mL，置于37 ℃环境中培养，分别于0、6、12、24、36、72 h进行细菌计数，重复3次。

1.7 中药提取物(浓度1/2MIC)对生物被膜下猪链球菌的杀灭作用 将浊度为0.5 麦氏单位的菌液稀释为约1.0×106CFU/mL，向卡尔加里生物被膜装置每孔中加菌液和各药液共200 μL(药物浓度 1/2 MIC)，另设空白对照孔(只含培养基)和阴性对照孔(未加药的生物被膜生长对照)，每个样品5个重复，37 ℃，50 r/min 摇床上孵育72 h，从卡尔加里生物被膜装置上取下形成生物被膜的桩钉，并使用灭菌PBS(pH值7.2)轻轻洗涤3次以去除游离菌，加入1 mL THB 培养基，置于超声脱气仪超声振荡，使生物被膜上的细菌剥脱至培养基内。取10 μL 菌液，用THB 液体培养基做10 倍稀释，从10倍稀释至10 000倍。在THB固体平板上37 ℃培养24 h 后计数，每次测定均重复测3 次计算平均值，结果以log(CFU/mL)表示，观察药物对生物被膜内菌量影响[4]。

1.8 扫描电镜观察生物被膜的形态 首先从卡尔加里生物被膜装置上取下桩钉，并使用灭菌水PBS(pH 值7.2)轻轻洗涤3 次，除去游离菌，用pH值7.2 戊二醛固定，并置于4 ℃中固定1 h，1 次用pH 值7.2 PBS 冲洗两次，每次均为0.17 h，再用50%、70%、90%进行脱水各1 次，每次0.17 h，然后用100%乙醇与叔丁醇1∶1，和叔丁醇各脱水1 次后，每次0.25 h，用低温干燥仪对样品进行干燥4 h，样品表面在真空条件下镀一层厚度为100A 的金属膜，在SEM 下观察。

2 结果

2.1 中药水提物、阿奇霉素对猪链球菌最小抑菌浓度 通过肉汤微量稀释法分别测定了各中药水煎液对猪链球菌分离株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，结果见表1。

表1 20种中药对猪链球菌的MIC和MBC (单位：mg/mL)

2.2 中药提取物(浓度1/2MIC)对猪链球菌生物被膜的干预作用 见图1，柱形图由左向右依次为：连翘、丁香叶、金银花、柴胡、大黄、鸭跖草、仙鹤草、千里光、野菊花、黄连、黄芩、板蓝根、大青叶、穿心莲、黄柏、紫菀、贯众、鱼腥草、荆芥、诃子、阳性对照组(阿奇霉素)和阴性对照组。与阳性对照组相比，丁香叶组、金银花组、黄芩组、穿心莲组、黄柏组与鱼腥草组对猪链球菌生物被摸的形成有抑制作用(P<0.05)。大黄组、黄连组对猪链球菌生物被摸的形成有明显的抑制作用，与阳性对照组比较差异极显著(P<0.01)。

图1 20种中药对猪链球菌生物被膜干预的作用(n=5，X±SD)

2.3 中药提取物(浓度1/2MIC)对猪链球菌生长的影响 见图2中药提取物(浓度1/2MIC)时，丁香叶、金银花、黄芩、大黄、黄连、穿心莲、黄柏与鱼腥草对猪链球菌生长的影响，同时设置阳性对照组(阿奇霉素)和阴性对照组。与阴性照组比较，中药水提物对细菌数量影响差异不显著(P>0.05)。

图2 中药提取物(浓度1/2MIC)对猪链菌生长的影响

2.4 中药提取物(浓度1/2MIC)对生物被膜下猪链球菌的杀灭作用 (见图3)柱形图由左向右依次为：连翘、丁香叶、金银花、柴胡、大黄、黄连、穿心莲、鱼腥草、黄柏、紫菀、大青叶、板蓝根、诃子、荆芥、千里光、野菊花、阳性对照组(阿奇霉素)和阴性对照组。丁香叶对生物被膜下的细菌具有显著的杀灭作用(P<0.05)，大黄、黄连对生物被膜下的细菌具有极显著的杀灭作用(P<0.01)。

图3 中药提取物(浓度1/2MIC)对生物被膜下猪链球菌的杀灭作用

2.5 扫描电镜观察生物被膜的形态 由图4可见，通过扫描电镜观察阴性对照组、丁香叶、大黄、黄连和阳性对照组生物被膜的形成情况，(A)阴性对照组形成厚厚的黏液样生物被膜，大量细菌镶嵌被膜中。(B)、(C)和(D)为丁香叶、大黄和黄连水提物对生物被膜的抑制作用，形成黏液样生物被膜量极少，细菌裸露在物体表面。(E)是阳性对照组，阿奇霉素具有很好的对细菌的杀灭作用，细菌数量非常少，没有形成生物被膜。

图4 扫描电镜观察生物被膜的形态学

A：阴性对照组； B、C、D、E：分别为丁香叶、大黄、黄连和阳性对照组

3 讨论

目前国内外研究结果表明，十四、十五元环大环内酯类药物具有干预或者消除S.suis生物被膜的作用[5]，但不是畜禽专用药物。菌体也能减少猪链球菌生物被膜的形成，破坏生物被膜的结构，但是其与抗菌药物联合应用效果最好[6]，这些均限制了它们在兽医临床上的应用。由于中草药中含有大量结构不同的化学成分，是新药研究的宝贵资源，目前已发现松红梅、蒲公英、甘草、牛膝具有抑制伪中间葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、变异链球菌生物被膜形成的作用，所以从中药中筛选新的干预∕消除生物被膜药物已成为当前研究的热点。

连翘、丁香叶、柴胡、金银花、大黄、板蓝根、大青叶、黄连、鱼腥草、黄芩、黄柏、紫菀等20味中药属于辛凉解表或者清热解毒类中药，在临床中常用且抑菌效果较好的一类抗菌中药。如莲花清瘟胶囊有抗金黄色葡萄球菌生物被膜形成的作用、金银花有抑制大肠埃希菌生物被膜的活性、鱼腥草水提液与阿奇霉素连用对铜绿假单胞菌抗生物被膜效果较好、中药单体连翘苷和黄芩苷对表皮葡萄球菌生物被膜有抑制作用，还未见他们对猪链球菌生物被膜的抑制作用，故本试验通过微量稀释法测得20味中草药对猪链球菌的MIC和MBC，及结晶紫染色法测得对猪链球菌生物被膜的干预作用，结果显示，黄连、黄柏、诃子抑菌杀菌效果最好；连翘、丁香叶、大黄，鸭跖草、黄芩、板蓝根次之。大黄、黄连对生物被膜形成抑制作用明显，丁香叶、金银花、黄柏、黄芩、鱼腥草、穿心莲次之[7-10]。

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Screening of Chinese herbal extracts against Streptococcus suis biofilm formation

CHEN Jian-qing ， ZHOU Yong-hui ， YANG Yan-bei ， BAI Jing-wen ， LI Yan-hua

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030， China)

In order to investigate the hypothesis that Chinese herbal eradicate the biofilm，we first determined the activity of twenty Chinese herbals which are often used for heat-clearing and detoxifying in traditional chinese prescription against planktonic cultures ofStreptococcussuisby the microdilution technique.The twenty Traditional Chinese medicines(TCMs)inhibited the growth ofStreptococcussuis(S.suis)planktoic cells at minimum inhibitory concentration(MIC).The assay was performed at sub-MIC levels and showed that Flos caryophylli，Flos Lonicerae，Scutellaria，Andrographitis，cordate houttuynia and golden cypress extracts inhibit the biofilm formation(P<0.05).Chinese rhubarb and Coptis chinensis extracts significantly inhibited the biofilm formation(P<0.01).The effect of TCMs on the bacteria was not significant(P>0.05)by count in 0～72 h.Flos caryophylli，Chinese rhubarb and Coptis chinensis showed a strong bactericidal activity against the biofilm-forming cells compared with the negative control.The findings suggest that Flos caryophylli，Chinese rhubarb and Coptis chinensis not only inhibit the biofilm formation but also disinfect bacterial cells under biofilm.

Traditional Chinese medicines ； biofilm ；Streptococcussuis

LI Yan-hua

2015-12-24

国家科技支撑计划子课题(2015BAD11B03-07)

陈俭清(1982-)，男，实验师，硕士，主要从事兽医药理与毒理学研究，E-mail：chen-jianqing@hotmail.com

李艳华，E-mail：liyanhua1970@163.com

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0014-03