中哈边境阿拉山口口岸输入性亚洲璃眼蜱的种类鉴定与分析

徐 军 ， 王安东 ， 戴 莉 ， 杨 杰 ， 罗 丹 ，徐建军 ， 李志远 ， 热依罕古丽 ， 萨尼叶古丽

(1.新疆出入境检验检疫局 ， 新疆乌鲁木齐832000 ； 2.石河子大学动物科技学院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境检验检疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大学医学院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆乌鲁木齐830052)

中哈边境阿拉山口口岸输入性亚洲璃眼蜱的种类鉴定与分析

徐 军1， 王安东2， 戴 莉3， 杨 杰3， 罗 丹4，徐建军5， 李志远2， 热依罕古丽5， 萨尼叶古丽5

(1.新疆出入境检验检疫局 ， 新疆乌鲁木齐832000 ； 2.石河子大学动物科技学院 ， 新疆石河子832000 ；3.阿拉山口出入境检验检疫局 ， 新疆阿拉山口833418 ； 4.石河子大学医学院 ， 新疆石河子832000 ；5.新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆乌鲁木齐830052)

对1批从哈萨克斯坦进口羊毛中检获的蜱样品进行种类鉴定。应用16S rDNA基因和COI基因两条DNA条形码技术进行鉴定分析。结果16S rDNA序列分析显示与新疆亚洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列分析显示与新疆伊犁亚洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。结论：经DNA条形码比对，确定为亚洲璃眼蜱，应加强对外来医学媒介生物防控，严防“外来病”入侵。

亚洲璃眼蜱 ； 种类鉴定 ； 16S RNA ； COI ； 线粒体 ； 阿拉山口口岸

羊毛和毛皮是纺织服装和毛皮行业的重要生产原料，我国毛纺织工业和毛皮行业快速发展，国内羊毛和毛皮原料供不应求，每年需从国际市场购进大量羊毛和毛皮。羊毛夹带是检疫监管中老大难问题。有文献显示，羊毛能携带炭疽、小反刍兽疫、布鲁菌等动物传染病的病原体、媒介生物和植物种子等[1]。利用传统方法分析蜱种的系统进化具有很大局限性，尤其体现在以下情况：形态学特征很相似的物种、标本破坏、缺乏未成蜱的性状描述或采集的标本为饱血个体。随着研究技术的飞速发展，DNA 条形码技术为物种鉴定、种群研究及系统进化分析提供了有效途径[2]。本研究尝试使用DNA 条形码技术，对入境羊毛夹带的残缺蜱进行种类鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料 2015 年从哈萨克斯坦进境的一批羊毛夹带中检出一批蜱，共23只，样本损坏严重，无法镜检。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit 说明书，进行DNA 提取(1只/份)，将提取的DNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 根据张璘[2]，Rees D J[3]已经报道的16S rDNA、COI 序列进行PCR。引物序列及其相应扩增条件见表1。50 μL PCR 反应体系包含如下成分：25 μL 2×TaqPCR Master Mix，1 μL 10 mmol/L 上游引物，1 μL 10 mmol/L 下游引物，2 μL DNA模板，21 μL ddH2O。

表1 引物及其反应条件

1.2.3 序列分析及分子遗传进化分析 将PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果与GenBank中进行Blast进行同源性分析，然后使用Mega6.0软件进行遗传进化分析，构建分子系统进化树。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 通过PCR扩增上述23只蜱样本线粒体DNA，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均获得特异性很好的PCR产物，与预期目的片段一致(图1)。

图1 蜱16S rDNA和COI PCR电泳结果

M：DNA Marker ；左1～3：蜱样本16S rDNA PCR产物；右1～3：蜱样本COI PCR产物

2.2 DNA条形码技术分析 经测序，16Sr DNA基因测得21条序列，COI基因测得21条序列。DNAMAN分析显示，16S RNA和COI基因序列之间存在多样性，16S rDNA可以获得6个不同序列(KU183532-KU183537)，COI可以获得17个不同序列(KU364317-KU364334)。经Blast分析，所有蜱样本均与亚洲璃眼蜱同源性最高。其中，16Sr DNA序列显示与新疆亚洲璃眼蜱(KC203351)同源性最接近(99%)；COI基因序列显示与新疆尉犁亚洲璃眼蜱(KF527440)同源性最接近(99%)。从分子系统发育树最大似然分析可知，16Sr DNA基因序列与亚洲璃眼蜱(KC203351，新疆)(KP400549，新疆阿拉山口)(KF527439，新疆尉犁)(JX051092，内蒙古)聚为一支，COI基因序列与亚洲璃眼蜱(KF527440，新疆尉犁)(JQ737073，甘肃)(JQ737070，新疆)(JX051141，内蒙古)(KF583578，新疆)聚为一支。

3 讨论

随着分子生物学的发展，蜱的分子分类学鉴定开始应用并发展起来[4-5]在蜱类物种鉴定和系统研究中起了非常重要的作，用。16S rDNA是动物线粒体较保守的基因，进化速率缓慢，以替换为主，可用保守引物或通用引物定位并进行PCR扩增；COI基因是线粒体蛋白编码基因之一，可以自由变异，且COI的演化速率是其他蛋白编码基因的3倍，有足够的变异能够将物种区别开来，COI 还具有较少的插入和缺失，两端序列有相对的保守性的特点，是较好的分子标记[2]。本研究通过使用16SrDNA和COI两条DNA条形码，成功对从哈萨克斯坦输入性亚洲璃眼蜱进行分子鉴定，对加强口岸医学媒介的查验和监测有较大的指导意义。由此可见：DNA条形码能够准确、快速地鉴定外来蜱种，为口岸地区蜱类鉴定提供新思路。

2008年阿拉山口出入境检验检疫局在3批哈萨克斯坦国进口的牛皮中连续亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱和盾糙璃眼蜱[6]，本次在哈萨克斯坦进口羊毛夹带中检出亚洲璃眼蜱。因此，硬蜱在阿拉山口口岸进口动物产品中具有较高的输入风险。亚洲璃眼蜱主要生活在荒漠或半荒漠地区，通常寄生于骆驼，牛，马，羊等家畜以及刺猬，野兔等，也侵袭人。哈萨克斯坦地处欧亚大陆中部，共有4个自然带：森林草原带、草原带、沙漠带和半沙漠带[7]，哈萨克斯坦自然环境与我国新疆十分相似。加之亚洲璃眼蜱是新疆出血热病原体的携带者，此外，该蜱还能自然感染Q热，北亚蜱媒斑点热、蜱媒脑炎等，并是牛环形泰勒虫的传播媒介[8]。Tumanova IIu在 2001-2003年对哈萨克斯坦和塔吉克斯坦的亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱和银盾革蜱中克里米亚-刚果出血热病毒监测中首次发现哈萨克斯坦存在非洲样的克里米亚-刚果出血热病毒[9]。因此，一旦活亚洲璃眼蜱随动物产品输入新疆，将会定居繁殖，并对新疆当地人和家畜造成危害。

阿拉山口作为“一路一带”向西开放的桥头堡，国外大量牛、羊、皮毛从口岸借助交通工具携带媒介生物入境，增加了虫媒病传入我国的风险。因此应加强对口岸地区媒介生物的检测，同时加强对入境易染动物及其产品的监督监测，严格消毒，严防“外来病”的入侵。

[1] 顾志军，徐金祥，沈涛，等.进境羊毛有害生物防控及监管措施探讨[J].检验检疫科学，2008(1)：56-58.

[2] 张璘.新疆北疆地区蜱种分布及蜱源性病原检测方法的建立[D].石河子：石河子大学，2014：47-48.

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[7] 中华人民共和国驻哈萨克斯坦共和国大使馆经济商务参赞处.哈萨克斯坦的农业和畜牧业[EB/OL].[2004-03-19].

[8] 刘继荣，米来，王平福，等.准噶尔盆地硬蜱区系考察与名录记述[J].中国动物传染病学报，2013，21(1)：60-65.

[9] Tumanova IIu，Seregin S V，Vyshemirskii O I，etal.Genetic monitoring of the Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus in Kazakhstan and Tajikistan in 2001-2003[J].Mol Gen Mikrobiol Virusol，2006(2)：36-41.

Species identification of an imported tick sample ofHyalommaasiaticumasiaticum by genetic analysis at Alashankou port，China- Kazakhstan border

XU Jun1， WANG An-dong2， DAI Li3， YANG Jie3， LUO Dan4，XU Jian-jun4， LI Zhi-yuan2， RE Yi-han-gu-li5， SA Ni-ye-gu-li5

(1.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Urumqi 830000，China ；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China ； 3.Alashankou Entry-Exit Inspection and Quarantine Authority of the PRC，Alashankou 833418，China ； 4.College of Veterinary Medicine，Shihezi University，Shihezi 830052，China ；5.College of Veterinary Medicine ， XND ， Urumqi 830052，China)

To identify the species of ticks in wool samples from Kazakhstan at Alashankou port，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China.The 16S rDNA and CO1 identification were carried out for the ticks，and sequence analysis was performed to establish the molecular phylogenetic tree.The 16S rDNA and COI were clustered together withHyalommaasiaticumasiaticum(accessionnumbers：KC203351，KF527440)；these strains had the highest homology withHyalommaasiaticumasiaticum(99%).Based on DNA barcode comparison，the imported tick sample was identified asHyalommaasiaticumasiaticum. We should strengthen the prevention and control of imported medical vectors，to prevent the "Exotic Diseases".

Hyalommaasiaticumasiaticuma； Speciesi dentification ； 16S rDNA ； COI gene ； Alashankou Port ； China-Kazakhstan border

2015-11-05

新疆维吾尔自治区自然科学基金(201442137-1)；国家质检总局科技计划项目(2014IK239)；公益性行业(农业)科研专项(201103008)

徐军(1969-)，男，高级兽医师，硕士，从事动物检验工作，E-mail：alskxj@sina.com

王安东(1990-)，男，硕士生，从事兽医卫生监督与管理研究工作，E-mail：wadshzu@163.com

Q969

A

0529-6005(2016)11-0017-02

注：王安东与徐军对本文具有同等贡献