云南师宗和江苏盱眙中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列分析

胡 骑 ， 王静林 ， 何于雯 ， 孙 强 ， 吴 晶

(云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南省畜牧兽医科学院， 云南昆明650224)

云南师宗和江苏盱眙中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列分析

胡 骑 ， 王静林 ， 何于雯 ， 孙 强 ， 吴 晶

(云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南省畜牧兽医科学院， 云南昆明650224)

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列特征， 2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本， 通过形态学鉴定出中华按蚊， 再提取蚊虫基因组DNA， 用COII基因特异引物和序列测定， 然后采用生物信息学软件进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。 结果在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只， 其中按蚊234只(74.52%)；在江苏省盱眙县桂五镇采集蚊虫标本212只， 其中按蚊143只(67.45%)。 经形态学鉴定， 每个地方挑选了8只疑似中华按蚊进行序列分析， 结果显示，16只蚊虫COII核苷酸序列同源性在98%-100%之间， 遗传进化分析显示，16只蚊虫全部与中华按蚊位于同一进化分支内。 表明了采用分子鉴定的方法可有效地进行蚊虫种类鉴定。

中华按蚊 COII基因 分子鉴定

中华按蚊(An.sinensis)是按蚊中分布最广且最常见的种类之一；它偏嗜动物血液，外栖或半外栖，种群数量大，是我国以往文献记载中疟疾和丝虫病的重要传播媒介，对人类和家畜动物危害极大[1-2]。但与其他按蚊形态学上非常相似，用传统形态分类的方法很难对这些蚊虫进行准确鉴定[2]。因此，本文对采集的中华按蚊进行分子鉴定以及COII基因序列分析，从分子水平了解采集的蚊虫标本与中华按蚊的遗传进化关系，为研究我国蚊虫分子分类提供资料，这对预防和控制以中华按蚊为传播媒介的疾病发生和传播具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 标本采集 2014年7月在云南省师宗县县城周围和江苏省盱眙县桂五镇农户家牛圈采用诱蚊灯(功夫小帅，12 V; 300 mA; 湖北武汉)进行标本采集，采集时间段约为晚间18:00至次日早晨8:00共14 h。次日早晨收集标本，将标本置于-20℃冰箱中冷冻20～30min，待存活的蚊虫刚好冷冻死亡后，取出标本根据蚊虫形态学特征采用解剖镜进行蚊虫形态学鉴定，将形态学鉴定为按蚊的蚊虫标本放入70%乙醇中保存。

1.2 蚊虫DNA提取及PCR扩增 从乙醇中取出按蚊标本，在解剖显微镜下分离头胸部及腹部，腹部用DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)按说明书提取蚊虫DNA，操作步骤如下：每只按蚊标本用缓冲液GA 200 μL，充分研磨，加20 μL Proteinase K，56 ℃温浴过夜，加200 μL缓冲液GB混匀，70 ℃放置10 min。加200 μL无水乙醇充分混匀15 min，过柱，分别用500 μL缓冲液GD和 600 μL 漂洗液PW洗涤，加 60 μL 洗脱缓冲液TE洗脱DNA。取2 μL cDNA做反应模板，用COII特异引物[3]进行PCR扩增，依次加入10XBuffer 5 μL、2.5mmol /ld NTP 5 μL、上下游引物各1.25 μL、rTaq酶0.75 μL、去离子水31.75 μL，充分混匀，94 ℃预变性5 min，94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃60 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，1%琼脂糖电泳检查扩增条带，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit纯化PCR扩增产物，PCR扩增产物由昆明硕科公司进行测序。

1.3 序列分析 使用Clustal X Version 2.1 软件包进行病毒基因核苷酸序列比对，DNASTAR 软件中MegAlign进行核苷酸序列同源性分析。使用MEGA5.05 软件完成基于Neighbor-joining (NJ) 方法的进化树绘制，bootstrap值为1 000。

1.4 使用日本奥林巴斯SZX-7解剖显微镜及明美显微数码成像系统对按蚊的头胸部进行照相，用于形态学鉴定。

2 结果

2.1 蚊虫采集 2014年7月在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只，在江苏省盱眙县桂五镇采集蚊虫标本212只，共526只。经形态学鉴定，云南省师宗县采集按蚊234只(74.52%)，库蚊23只(7.32%)，阿蚊45只(14.33%)，其他蚊虫12只(3.82%)；江苏省盱眙县桂五镇采集按蚊为143只(67.45%)，库蚊45只(21.23%)，阿蚊13只(6.13%)，其他蚊虫11只(5.19%)。表明在云南省师宗县和江苏省盱眙县，按蚊都是7月份的优势种类。

2.2 核苷酸序列同源性分析 从云南师宗县的蚊虫样品中取8只形态学鉴定为疑似中华按蚊的样品，标记为YN-SZ-1至YN-SZ-8(均为雌性，5只饱血，3只未吸血)；从江苏省盱眙县的蚊虫样品中取8只形态学鉴定为疑似中华按蚊的样品，标记为JS-1至JS-8(均为雌性，6只饱血，2只未吸血)。进行DNA提取和COII基因PCR扩增，总共16只蚊虫标本扩增均为阳性，经序列测定获得约740个核苷酸序列。16只按蚊的核苷酸序列同源性在98.4%至100%之间。总共16只中华按蚊与GenBank中的巨大按蚊，冈比亚按蚊，微小按蚊，中华按蚊，多斑按蚊和八代按蚊的相应序列进行分析(见表1)。所有的16只按蚊与中华按蚊的核苷酸序列同源性最高，在98.8%-100%之间，与巨大按蚊的核苷酸序列同源性最低，在78.62-80%之间，与冈比亚按蚊、微小按蚊、多斑按蚊的核苷酸序列同源性均低于90% ，与八代按蚊的核苷酸序列同源性在在 94.73%-95.93%之间。

表1 云南省师宗县和江苏省盱眙县按蚊的COII基因核苷酸序列同源性分析

图1 云南省师宗县和江苏省盱眙县采集中华按蚊COII基因(600nt)遗传进化分析

2.3 遗传进化分析 对两地采集的共16只蚊虫与GenBank中4条中华按蚊序列、2条八代按蚊序列、1条冈比亚按蚊序列、6条微小按蚊序列、3条多斑按蚊序列及1条巨大按蚊序列共6个种，17条按蚊序列一起构建系统进化树，见图1。结果显示，不同的按蚊种均形成较大的分支，与核苷酸序列同源性分析结果一致；云南省师宗县采集的8只蚊虫标本和江苏省盱眙县采集的8只蚊虫标本均位于中华按蚊分支内，与其他种的按蚊分支有明显区别，表示云南省师宗县采集的8只蚊虫标本和江苏省盱眙县采集的8只蚊虫标本均为中华按蚊。

2.4 形态学分析 雌蚊下颚有白环；翅前缘有明显的亚缘脉白斑和亚端白斑,基段可杂有少数淡色鳞，符合中华按蚊的形态学特征。

图2 江苏省盱眙县和云南省师宗县的中华按蚊形态学

3 讨论

DNA序列分析是鉴定生物体不同种、亚种和地理株，以及研究其系统进化关系的方法之一[4]。近年来，一些国内外学者采用线粒体基因COI、COII、COIII和ITS基因序列以及其他一些基因作为分子靶标进行蚊虫种类鉴定，其中线粒体基因COII进化速率适中，在能够保证足够变异的同时又很容易被通用引物扩增[5-6]。本试验采用COII基因作为分子靶标对云南省师宗县和江苏省盱眙县采集到的蚊虫标本进行分子鉴定，结果显示，16只形态学鉴定为中华按蚊的标本，在系统进化树上全部与中华按蚊位于同一进化簇，核苷酸序列同源性均在98%以上，符合蚊虫COII基因种内判定值98%以上[7]的要求。而其他进化簇的核苷酸序列同源性均低于96%，因此可确定这16只蚊虫标本均为中华按蚊。

大多数从事动物传染病病原研究的科研人员并没有良好的昆虫学背景，而蚊虫的种类极多，属内蚊虫在形态学上容易混淆产生错误，对不太熟练的科研人员尤其如此。因此本次研究中先进行形态学分类，剔除不同属的蚊虫以及容易辨别的蚊虫，再进行分子鉴定和遗传进化关系的研究，既提高了工作效率，也避免了形态学对相近蚊虫种类的错误分类，从分子水平较好明确这些蚊虫分类，为人和动物蚊传疾病的传播控制提供科学依据。

云南省曲靖市师宗县和江苏省淮安市盱眙县，地理位置相距2 000 km，海拔高差1 500 m以上，气候环境相差巨大，但两地的蚊虫在7月份都是按蚊占绝对优势(67%)以上，且两地的中华按蚊在核苷酸序列同源性和系统发育上并没有明显区别。两地的按蚊在种类分布、核苷酸序列同源性和系统发育方面的区别有待进一步研究。

[1] 雅军，瞿逢伊，徐建农，等.我国中华按蚊群体分子遗传多态研究[J]. 昆虫学报， 2001, 07(2):56-58.

[2] Wang J,Zhang H，Sun X,etal.Distribution of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Yunnan Province near the China-Myanmar-Laos border [J].Am J Trop Med Hyg， 2011,84(5):738-746.

[3] Flomer O，Black M. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J]. Mol Mar Bio and Bio, 1994, 3: 294-299.

[4] 黄朝晖，王金福. 三种蚊虫COIl基因的克隆与序列分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2001,19(2):90-92.

[5] 王刚. 基于 DNA 条形码基础上的我国主要蚊虫分子分类系统的建立[D]. 北京：中国人民解放军军事医学科学院，2011.

[6] Monaghan M T,Balke M,Gregory T R,etal.DNA-based species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers [J]. Phil Trams R Soc B, 2005, 360: 1925-1933.

Molecular Identification and COII gene analysis of Anopheles sinensis from Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province

HU Qi, WANG Jing-lin, HE Yu-wen, SUN Qiang, WU Jing

(Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory Animal Science and Veterinary Institute，kunming 650224,China)

To understand the molecular taxonomy ofAn.sinensisand the characteristics of COII gene in Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province. In July 2014, we collected insects from Shizong County, Yunnan Province and Xuyi County, Jiangsu Province. We first identifiedAn.sinensisby insect morphology. And then the genome DNA of mosquitos were extracted and amplified by COII gene specific primers and sequenced, which were analyzed by bioinformatics software for nucleotide sequence homology and phylogenetic relationships.We collected 314 insects from Shizong County, Yunnan Province, including 234Anopheles(74.52%, and 212 insects from Xuyi County, Jiangsu Province, including 143Anopheles(67.45%). We identified them by morphology, and then selected 8 suspectedAn.sinensisfrom each of the two places for sequencing analysis. Results showed that the nucleotide sequence homology of all 16 insects COII genes varied from 98%-100%, and the phylogenetic analysis showed that all 16 insects andAn.sinensislocated in the same cluster. Molecular identification method is a very effective way to identify mosquito species.

An.sinensis; COII gene; Molecular Identification

WANG Jing-lin

2016-05-03

云南省科技计划青年项目(2014FD075)

胡骑(1980- )，男，助理研究员，硕士，从事动物传染病原研究，E-mail：ynkmhq999@163.com

王静林，E-mail：Wangjl107@163.com

S855

A

0529-6005(2016)11-0020-03