牛病毒性腹泻病毒(BVDV)持续感染牛的筛查与胚胎移植

唐 燕 ， 孟小林 ， 贾林军 ， 刘晓娜 ， 李 桉 ， 范洪先

(1.新疆农业职业技术学院， 新疆昌吉831100 ； 2.新疆豪子畜牧业有限公司， 新疆奇台831800)

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)持续感染牛的筛查与胚胎移植

唐 燕1， 孟小林1， 贾林军1， 刘晓娜1， 李 桉1， 范洪先2

(1.新疆农业职业技术学院， 新疆昌吉831100 ； 2.新疆豪子畜牧业有限公司， 新疆奇台831800)

为了保证胚胎移植的效果， 达到良种繁育的目的， 对胚胎移植的受体牛进行了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)-持续感染(PI)牛的筛查。 首先采取受体牛血清样本， 然后提取样本RNA， 反转录为cDNA， 进行RT-巢式PCR， 根据琼脂糖凝胶电泳结果， 确定受体牛是否是BVDV-PI牛。 初次检测结果为阴性的牛， 可作为胚胎移植的备选牛。 初检阳性的牛， 进行隔离， 3周后进行复检， 连续进行两次复检， 如果3次检测结果都为阳性， 认定该牛为BVDV-PI牛， 予以淘汰。 如果复检为阴性， 则判为BVDV急性感染牛， 可继续使用。 结果108头受体牛中， 确认3头受体牛为BVDV-PI牛， 予以淘汰， BVDV-PI牛阳性率2.8%。 剩下的105头受体牛， 通过直肠检查可用于胚胎移植的81头。 45天后孕检， 怀孕61头， 受胎率75.3%。

BVDV-PI牛筛查 ； RT-巢式PCR ； 胚胎移植 ； 受胎率

在过去50多年里，通过严格的基因筛选，奶牛牛奶产量有了大幅增长。但是在高产奶牛，尽管有大量的兽医工作者参与其中，奶牛的繁殖率下降一直困扰着牛场[1]。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种牛生殖系统病原体，它可降低牛受胎率，引起流产，产生持续感染牛(Persistent infection，PI)[2-3]。BVDV-PI牛一般是母牛怀孕早期感染非细胞病变型(noncytopathic，NCP)BVDV后，NCP BVDV突破胎盘屏障感染胎儿后形成的。有些BVDV-PI牛没有临床症状，但其血液中含有107TCID50/mL BVDV[4]，可以排毒，成为传染源造成疫病流行。因此，防范怀孕母牛接触BVDV，是防止BVDV-PI牛产生的根本。另外，BVDV还可引起受精失败或早期胚胎死亡，进而导致反复配种[5]。

胚胎移植(ET)技术是提高家畜生产性能和缩短育种进程的有效途径，胚胎冷冻保存和移植技术在推动畜牧业发展和加快优良品种发挥着越来越重要的作用，近几年来被广泛应用于牛的生产。新疆昌吉州某牛场，为了进行良种繁育，决定进行胚胎移植。牛场进行了“两病”检疫工作，但从未进行过BVDV筛查工作，根据文献报道，新疆地区BVDV最高抗体阳性率均在90%以上，部分奶牛场犊牛死亡率达45%[6]，从这些数据可看出，新疆地区BVDV感染非常普遍，而且严重的影响了新疆养牛业的发展。牛场进行此病的筛查十分有必要，尤其是进行良种繁育的牛场。本试验采用美国高产荷斯坦奶牛体内法生产的优质冷冻胚胎，采用直接移植法，移植后代母牛建立高产奶牛核心群，公牛进入公牛站，进行后裔测定。受体牛为15月龄以上的荷斯坦青年母牛。

1 材料

1.1 试验动物 受体牛为15月龄以上荷斯坦青年母牛108头，膘情中、上等，体况评分3.0以上。“两病”检疫为阴性，从未免疫猪瘟疫苗或牛病毒性腹泻疫苗。TMR全混饲喂，3次/d。

1.2 样本信息 108头受体母牛的血清样本。

1.3 胚胎来源 美国高产荷斯坦奶牛体内法生产的优质冷冻胚胎。

1.4 试剂、药品及耗材 超纯RNA 提取试剂盒、cDNA第一条链合成试剂盒、DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)；盐酸利多卡因注射液(晋城海斯制药有限公司)；氯前列烯醇钠注射液(丹东市绿丹和华动物药有限公司,0.2 mg/支)；注射用促性腺激素释放激素(苏州市苏牧动物药业有限公司,100 μg/支)；胚胎移植枪、塑料硬外套、无菌软外套、长手套(法国卡苏)；兽用RX一次性采血盛血器(衡州市荣欣医疗器材有限公司)。

1.5 仪器设备 50s TRINGA VET便携式兽用B超仪(PIEMEDICAL)；PCR仪(eppendorf)；Molecular Imager ® Gel DocTMXR+ system凝胶成像系统(Bio-Rad)。

2 试验方法

2.1 引物设计与合成 根据GenBank公布的BVDV 5'UTR保守区域基因序列设计引物。首先应用 Primer 5.0软件设计引物，然后将设计的引物进行Blast比对，以确定所用引物的特异性，最后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列见表1。

表1 巢式PCR引物

2.2 RT-巢式PCR

2.2.1 RNA 提取与 cDNA 合成 按照超纯RNA 提取试剂盒，cDNA 第一条链合成试剂盒的说明书提取受体牛血清样本中的RNA，并反转录成cDNA，以此为模板，进行后续巢式PCR。

2.2.2 巢式PCR 以样本cDNA作为模板，引物 F1/F2 进行第一轮PCR扩增，反应结束后， 取第一轮PCR产物作为模板，分别以引物P1/P2、 P3/P4 进行第二轮扩增，然后取10 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、分析样本的BVDV感染情况。具体PCR体系见表2，PCR 程序设定为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。巢式PCR阳性对照模板为：BVDV Oreron C24V接种MDBK后，提取RNA，反转录的cDNA；阴性对照模板为：ddH2O。

初次检测结果为阴性的牛，可作为胚胎移植的备选牛。检测结果为阳性的牛，进行隔离，3周后再次采取血清，进行复检，连续进行两次复检。如果复检结果仍为阳性，该牛确定为BVDV-PI牛，予以淘汰。如果复检为阴性，则判为BVDV急性感染牛，可继续使用。

表2 PCR体系

2.3 胚胎移植

2.3.1 发情观察及催情处理 全群荷斯坦受体牛每天观察发情，计入发情记录，然后对照繁殖记录看月龄是否达到15月龄。移植前直肠检查时，观察体重是否达到成年体重的70%。定期对月龄、体重达标，但不见发情的青年受体牛进行直肠检查，使用氯前列烯醇(PGF2a)、促性腺激素释放激素(Gnrh)进行催情处理。

2.3.2 胚胎移植 受体牛发情第1天作为0 d，第7天做胚胎移植，通过直肠检查卵巢及子宫状况，卵巢上有直径大于1.0 cm以上的功能性黄体的受体牛进行移植，胚胎解冻，胚胎从液氮中取出后在空气中停留10 s，然后32 ℃水浴15 s，取出用洁净卫生纸擦干管壁，剪去封口端1 cm，装入移植枪移植，受体牛外阴部清洗消毒，做镇静处理和硬膜外鞘麻醉，将胚胎移植于受体牛子宫黄体侧，移植部位是有功能性黄体一侧子宫角深部。移植操作中避免损伤子宫内膜。移植结束45 d直肠检查结合B超，根据子宫变化确认妊娠状况。

3 结果

3.1 通过分析RT-巢式PCR琼脂糖凝胶电泳结果，108头受体牛中，初检97头牛呈阴性，可用于胚胎移植；另有11头牛血清样本，经 P1/P2引物扩增到了195 bp大小的片段 ，而经P3/P4引物扩增所有受体牛血清样本均为阴性,这11头牛进行隔离，BVDV感染率为10.2%。3周后复检这11头牛，8头牛转为阴性，可作为后续胚胎移植的备选牛；3头牛呈BVDV阳性，3周后复检第2次，3头牛仍为BVDV阳性，确认这3头牛为BVDV-PI牛，予以淘汰，BVDV-PI牛阳性率2.8%。部分检测结果见图1。

图1 RT-F巢式PCR琼脂糖凝胶电泳结果

M：DNA Markers 600； 1:阳性对照BVDV Oreron C24V； 2～6:样本DNA； 7:阴性对照ddH2O

3.2 除去BVDV-PI牛，剩下的105头受体牛，通过直肠检查确定有81头牛可用于胚胎移植,胚胎移植45 d后直肠检查结合B超进行孕检，怀孕61头，受胎率75.3%。

4 讨论

4.1 胚胎移植前，进行BVDV-PI牛筛查，净化了牛群，在良好的胚胎移植操作基础上，可提高移植的受胎率，同时也保证了怀孕母牛及犊牛的健康，真正做到良种繁育。根据BVDV筛查结果，可知道受体牛感染的是BVDV I型。

4.2 技术人员的熟练程度对胚胎移植受胎率有很大的影响。非手术移植时，胚胎移植的部位以及移植时是否引起子宫损伤，是影响牛胚胎移植受胎率高低的主要因素之一，因此准确的判断黄体和子宫环境，将胚胎放到子宫的恰当位置至关重要。首先，移植前检查受体牛卵巢是否有功能性黄体存在。其次，一定要用利多卡因尾椎硬膜外鞘麻醉，松弛子宫平滑肌，便于后续移植操作。最后，移植时，握移植枪的手只要轻微带一点劲，主要靠直肠内的手操作，使移植枪穿过子宫颈。移植枪进子宫角后直肠内的手要把移植枪头所在位置的子宫角拿直，使之与移植枪在一条直线上，移植枪随之前移，如此反复操作，使移植枪到达子宫角深部，最终进到子宫角再也拿不起来的位置为止。

4.3 此次胚胎移植，冻胚解冻后，没有进行胚胎形态观察，依然取得了好的移植效果，说明胚胎移植时，只要移植操作规范，冻胚质量高，解冻后可直接进行胚胎移植。

在胚胎移植前，进行BVDV-PI牛的筛查，不但可以减少移植后受胎率降低或流产率上升等不良事件的发生，也可以保证怀孕母牛及后代的健康，使牛场的良种繁育真正走向健康发展的道路。当前商业性胚胎移植的水平，非手术移植，冻胚移植受胎率平均为50%[7]。而此次胚胎移植的受胎率达75.3%，提示胚胎移植前，进行BVDV的筛查，有助于提高胚胎移植的受胎率。

[1] Perkel K J, Tscherner A, Merrill C,etal. The ART of selecting the best embryo: A review of early embryonic mortality and bovine embryo viability assessment methods[J]. Molecular Reproduction & Development, 2015, 82(11):822-838.

[2] Perry G H. Risk assessment of transmission of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in abattoir-derived in vitro produced embryos.[J]. Theriogenology, 2007, 68(1):38-055.

[3] Grooms D L, Brock K V, Pate J L,etal. Changes in ovarian follicles following acute infection with bovine viral diarrhea virus[J]. Theriogenology, 1998, 49(3):595-605.

[4] Brock K V, Grooms D L, Ridpath J,etal. Changes in levels of viremia in cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus[J]. J Vet Diagn Invest,1998,10:22-26.

[5] Bielanski A, Algire J, Lalonde A,etal.Embryos produced from fertilization with bovine viral diarrhea virus (BVDV)-infected semen and the risk of disease transmission to embryo transfer (ET) recipients and offspring[J]. Theriogenology, 2013, 80(5):451-455.

[6] 王龙，梁霄勇，季新成，等.新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分离、鉴定及分子流行病学调查[J].新疆农业科学，2015，52(2)：334-338.

[7] 李捷鑫，刘梦鹤,杨佳栋,等.奶牛高效繁殖技术应用的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2015(23):77-79.

BVDV persistently infectedcows screening and embryo transfer

TANG Yan1, MENG Xiao-lin1, JIA Lin-jun1, LIU Xiao-na1, LI An1, FAN Hong-xian2

(1.Xinjiang Agricultural Vocational Technical College, Changji 831100, China;2. Xinjiang Haozi Animal Husbandry Co. Ltd, Qitai 831800, China)

In order to ensure the effect of embryo transfer and improve breeding, recipient cows were screened to determine whether they are BVDV-PI cattle. First, recipient cows serum samples were collected, and then RNA was extracted, and used for BVDV analysis by RT-nested PCR. If the first test result of the recipient cows is negative, they can be used as an alternative cow for embryo transfer. Early detection of positive cows were isolated and rechecked after three weeks, and were then rechecked twice in a row. If the three test results were positive, the cow was identified as BVDV-PI cattle, and was eliminated. If the recheck was negative, the cow could be judged as an acute BVDV infection， and could be used. Three cows from 108 recipient cows were identified as BVDV-PI cattle, and were eliminated. BVDV-PI cattle positive rate of 2.8%. The remaining 105 recipient cows could be used for embryo transfer. And then, 81 cows were confirmed to be used for embyo transfer by rectal examination. After 45 days, pregnancy 61 were examined to be pregnant, and then pregnancy rate was 75.3%.

BVDV-PI cattle screening; RT-nested PCR;embryo transfer; pregnancy rate

FAN Hong-xian

2016-08-05

新疆农业职业技术学院科研基金项目(XJNZYKJ-2014002)

唐燕(1974- )，女，讲师，博士生，研究方向为疾病模型实验动物学，E-mail:1074086262@qq.com

范洪先，E-mail: 645969195@qq.com

S857.2+1

A

0529-6005(2016)11-0029-03