蛋白质组学技术及其在药物成瘾研究中的应用

朱贝贝，李翔宇，陈欢，张森，侯宏卫，胡清源

国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001

蛋白质组学技术及其在药物成瘾研究中的应用

朱贝贝，李翔宇，陈欢，张森，侯宏卫，胡清源

国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001

概述了蛋白质组学技术中分离、鉴定和定量方法及其在致瘾性药物（如酒精、烟碱、吗啡、可卡因和安非他命）研究中的应用。蛋白质组学技术是继后基因组学技术的一大重要突破。随着蛋白质分离、鉴定及定量技术的进步，尤其是覆盖范围广、分离效率高的液相色谱技术和高灵敏度质谱技术的发展，使得蛋白质组学越来越广泛地应用于药物成瘾研究，将有助于了解药物依赖过程中蛋白质的变化及其参与的生物过程和相关通路，理解药物成瘾的分子机制。

蛋白质组学；分离鉴定；定量蛋白质组学；药物成瘾

蛋白质组（proteome）的概念是由澳大利亚科学家Wilkins和Williams在1994年意大利科学会议上首次提出的，指基因组表达的所有相应蛋白质，即细胞、组织或机体存在的全部蛋白质及其活动形式[1]。蛋白质组学能够从整体角度动态分析细胞内蛋白质的组成、表达水平、修饰状态、生物功能及参与的生物过程和蛋白质之间的相互作用与联系规律。蛋白质组学技术已广泛应用于生物医学各个领域。药物成瘾是一种不正常的强迫性行为，尽管使用者知道这类药物的严重后果，但仍不能控制这些药物的使用。研究表明，反复接触致瘾性药物（如酒精、烟碱、吗啡和可卡因等）可以改变脑部特定区域蛋白质的表达水平和表达类型，这种表达的改变将介导个体神经元及其相关的神经通路，并由此可能产生与成瘾相关的异常行为[2]。因此，鉴定形成和维持成瘾相关的蛋白质是理解成瘾潜在分子机制的关键。蛋白质组学能够整体衡量药物成瘾过程中蛋白质组的动态变化（图1）。后续的生物信息学分析如基因本体注释（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释使得药物成瘾过程中蛋白质参与的生物学过程和相关通路更加清晰，因此可以增加对药物成瘾过程的理解，普遍适用于药物成瘾的研究。

图1 药物成瘾中蛋白质组学研究的技术路线

早期蛋白质组学（proteomics）是指采用双向凝胶电泳和质谱等技术分离和鉴定蛋白质，并用生物信息学的方法建立相关数据库来研究某一基因组表达的所有蛋白质及蛋白质之间的相互作用[3]。随着自下而上鉴定蛋白质裂解产物技术的发展，液相色谱分离技术和质谱鉴定技术逐渐应用于蛋白质组学的研究。蛋白质组学的发展有赖于分离、鉴定及定量技术的进步，尤其是覆盖范围广、分离效率高的液相色谱技术和高灵敏度的质谱技术的发展[4]。

1 蛋白质样品的分离

复杂的蛋白质样品需要经过进一步的分离，蛋白质样品分离的主要技术包括凝胶电泳和非凝胶液相色谱两大类，2种分离技术已广泛应用于药物成瘾蛋白质组学的研究（表1）。

1.1 双向凝胶电泳分离技术

蛋白质分离的传统技术主要是凝胶电泳，其原理是蛋白质在高压电场作用下首先根据蛋白质的等电点进行第一向等电聚焦分离，然后根据蛋白质的相对分子质量进行第二向聚丙烯酰胺凝胶分离。Song[10]等利用凝胶电泳分离技术研究了吗啡耐受性大鼠脊髓中蛋白激酶C（PKC）相关蛋白质的表达，结果显示吗啡耐受性大鼠和未基因敲降PKC正常大鼠脊髓中存在13种差异表达的蛋白质，第一次发现肌成束蛋白（FSCN）参与吗啡耐受性的调控。Saeideh[11]等基于此分离技术研究了吗啡依赖大鼠海马组织中蛋白质的表达，结果显示鉴定出的差异蛋白质可能通过调节海马神经元可塑性，诱导记忆障碍和吗啡依赖。用凝胶电泳分离技术分析鉴定的蛋白质并未充分涉及药物成瘾调控中发挥重要作用的关键蛋白质，如成瘾药物与神经相互作用的神经受体如乙酰胆碱受体，阿片肽受体和大麻素受体及调控递质释放的多巴胺、谷氨酰胺和氨基丁酸受体[12-13]。可能是因为在药物成瘾过程中这类蛋白质属于低丰度蛋白质，易被高丰度蛋白质掩盖，而凝胶电泳分离技术不易分离这类蛋白质。

表1 蛋白质分离技术的比较

1.2 非凝胶液相色谱分离技术

1.2.1 一维液相色谱分离技术 液相色谱分离效率高、分析速度快且重现性好，易于实现与质谱的自动联用[14]。对于简单的样品体系，单维色谱因其操作简单，易于自动化，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用[15]。在实际操作中，由于色谱系统反压过高，限制了超高压液相色谱在蛋白质组学研究中的广泛应用。许多蛋白质和肽的含量极低，需要高灵敏度的质谱仪才能检测，稳定高效的液相色谱分离技术将支持此微量样品的检测[16]。Bosch[6]基于纳升液相色谱分离技术鉴定出安非他明诱导的大鼠纹状体突触区双载蛋白、内吞蛋白B2、过渡ER腺苷三磷酸酶、B亚组V型质子腺苷三磷酸酶差异表达，这些差异表达的蛋白质在囊泡产生、激活和运输中具有重要作用。Wearne[17]等基于此技术鉴定出安非他明诱导敏化大鼠前额皮质区γ-氨基丁酸A型受体（GABAA）、多巴胺D2受体相关的桥尾蛋白（GPHN）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、钙离子水平相关的人视锥蛋白1（VSNL1）和钙调磷酸酶（PPP3R1）差异表达，研究表明多巴胺D2受体可能通过下游调节细胞内钙离子的水平，进而影响动物体的能量代谢、信号传导和多巴胺合成，导致生物体产生长期沮丧和认知功能紊乱。用一维分离技术鉴定出一些与成瘾药物作用受体相关的蛋白质[16-17]，但一维色谱由于其分辨率和峰容量有限，对复杂的蛋白质样品仍难以实现完全分离。

1.2.2 多维液相色谱分离技术 多维液相色谱分离技术是将2种或多种分离技术联合起来构建的分离平台，整个分离系统分离容量显著提高。理论上如果每一维的分离机理完全不同，即具有正交的分离机理，则系统可获得最大的峰容量n= ninj...[18]。Stockton[7]等基于二维分离技术研究了吗啡暴露组和对照组大鼠纹状体突触密集区蛋白质表达的变化，结果显示G蛋白偶联受体、蛋白降解和泛素化修饰等相关差异表达的蛋白质可能在阿片类药物成瘾中发挥重要作用。Oever[8]等基于二维液相色谱分离技术研究了海洛因复吸大鼠前额皮质蛋白质的表达，鉴定出与复吸易感性相关的神经递质分泌蛋白和基质膜蛋白差异表达，基质膜蛋白凝聚在氨基丁酸围绕的神经网络上，此改变可能激活氨基丁酸神经网络，进一步影响海洛因的复吸。基于高通量多维液相分离技术在药物成瘾蛋白质组学的研究中鉴定到神经递质释放、氨基丁酸相关蛋白质，进一步推动了药物成瘾蛋白质组学的研究。但多维液相色谱分离技术分析样品的速度较慢，尽管已有超高压液相色谱，但总体来说分离速度受到限制[19]。

1.2.3 高通量多维阵列液相色谱分离技术 多维阵列液相色谱是将多维色谱做成阵列式，“阵列”代表着多通道和同时分离，可以缩短多维液相色谱的分离时间。多维阵列式液相色谱技术能够实现高通量、高效率的分析，已逐渐应用于蛋白质组学的研究。Huang[9]等基于此技术研究了人的血浆样品，将分析时间由原来的1周缩短到4 h，鉴定蛋白质的浓度范围达9个数量级。高通量、高效率的多维阵列分离技术也将逐渐应用于药物成瘾蛋白质组学的研究。

表2 质谱鉴定技术比较

2 蛋白质样品的鉴定

质谱技术的发展为蛋白质鉴定提供了快速、准确的分析方法。质谱鉴定技术的进步之一是软电离技术的发现，这大大方便了生物样品中蛋白质和肽的鉴定。软电离技术主要包括2种基质辅助激光解吸电离（MALDI）[20]和电喷雾离子源（ESI）电离[21]。在药物成瘾应用中MALDI通常与飞行时间质谱（TOF）结合使用，ESI电离技术通常与轨道离子阱（Orbitrap）、离子阱（IT）、四级杆（Q）和傅里叶变换离子回旋加速（FT-ICR）结合使用（表2）。

2.1 MALDI-TOF鉴定技术

飞行时间质谱是较早时期能够高精度测试质量的手段之一，MALDI通常与TOF质量检测器结合使用，主要应用于自上而下的蛋白质组学。TOF以脉冲的模式实现离子的分离，通过测量每个离子在真空管中的飞行时间推导分析物的质量。Gorinic[23]基于MALDI-TOF和MALDI-TOF/ TOF技术研究慢性酒精戒断小鼠大脑皮质蛋白质表达的变化，鉴定到内吞和能量相关的肌动蛋白1差异表达，结果表明药物成瘾可能导致脑部适应性的变化和脑部重塑。MALDI-TOF广泛应用于药物成瘾蛋白质组学的研究，但此技术与上游兼容的技术联合使用很难鉴定成瘾中低丰度和极性蛋白质，且重复性差。

2.2 ESI-Orbitrap鉴定技术

轨道阱质谱是利用离子在特定静电场中运动频率的不同对离子进行质量分析，此技术不仅可以获得更好的数据质量，而且峰容量增加，从而可以检测更多低分辨率的信号[30]。Uys[26]等基于此鉴定技术研究了酒精诱导小鼠伏隔核突触密集区蛋白质表达的变化，结果表明59种差异表达的蛋白质中大多数蛋白质主要参与细胞形态的调节。Orbitrap能够提供蛋白质翻译后的信息，但相对于离子回旋质谱其分辨率略低。

2.3 ESI-TQ鉴定技术

离子阱是离子源产生的离子以脉冲的形式进入离子阱，从而实现高通量质量分析[27]。Lai[28]基于此质谱技术鉴定了酒精戒断者血液中潜在的生物标志物，结果标明女性中载脂蛋白C1和D及男性中载脂蛋白M和谷胱甘肽过氧化物酶等可做为酒精成瘾戒断者潜在的生物标志物。然而它的分辨率、离子捕获能力低和质量测量结果的准确性相对有限。

2.4 ESI-Q鉴定技术

四级杆具有高灵敏度和广泛的检测范围，通常与其他质谱串联用于蛋白质组学研究。Mi⁃chalski[29]基于Q-Orbitrap在90 min梯度时间内鉴定了胰蛋白酶消化的哺乳动物细胞裂解物中超过2500个蛋白质。据了解，此技术尚未应用于药物成瘾蛋白质组学的研究。

2.5 ESI-FT-ICR鉴定技术

FT-ICR的分辨率和精确度是质谱技术的重要突破，在蛋白质组学的研究中可精确鉴定一些低丰度的蛋白质及蛋白质翻译后的修饰。傅里叶变换回旋加速须在较高的磁场下进行，仪器操作复杂且费用较高[30]。此技术凭借其高的分辨率和精确度将有助于药物成瘾蛋白质的鉴定。

3 定量蛋白质组学技术

精确、可重复的定量蛋白质组学方法能够揭示蛋白质水平上相对小的变化，这些微小变化可能导致细胞表型或细胞信号的重大变化[31]。用于蛋白质定量的非凝胶方法包括非标定量法（lable-free）、同位素代谢标记（SILAC）、同位素亲和标签法（ICAI）、重同位素标签标记定量法（iTRAQ）[32]，如表3。

表3 蛋白组学定量方法的比较

3.1 非标定量技术

非标定量方法包括频谱计数和提取离子色谱图（XIC）2种。频谱计数依赖于所有蛋白质相应肽段的测序次数，蛋白质的丰度越高，较多数量的肽可用于测序，从而形成更多的MS/MS数。提取离子色谱图根据三围空间中肽离子的强度、m/z和色谱保留时间来定量。XIC的准确度高，更适合于中等丰度蛋白质的定量[37]。Sari[33]等基于非标定量技术研究了酒精诱导小鼠大脑蛋白质表达的变化，鉴定到对脑发育具有重要作用的抑制素和神经元迁移蛋白质显著下调。Bosch[6]等也基于此技术研究了安非他明诱导大鼠纹状体蛋白质的表达。非标定量蛋白质组学具有相对宽的动态范围，而且可以定量多个样品，但其精确度低、可重复性差，很难检测到低丰度蛋白质，且对仪器的精密度要求较高[41]。

3.2 SILAC定量技术

SILAC原理很简单：2组细胞同时培养时，A组在包含正常氨基酸（light）的培养基中，B组则在含有“重型（heavy）”氨基酸的培养基中，即稳定同位素标记的氨基酸。细胞传若干代后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入蛋白质中，取代了原有的氨基酸。这样，2个蛋白质之间就存在分子量的改变，而其化学性质无变化。SILAC定量方法简单，但仅适用于活体研究，且周期较长[39]。据了解在药物成瘾中没有应用。

3.3 ICAI定量技术

ICAT对含有L2半胱氨酸的巯基蛋白质或肽段样品分别予以轻、重标记。由于ICAT在化学结构上相同且在相对分子质量上相差8个中子，所以用MS检测时相对定量的可信性有所提高[40]。Morón[34]等基于ICAT研究了吗啡诱导组和正常组小鼠海马突触后密集区蛋白质表达的差异，结果显示差异表达的蛋白质可能通过调节突触上内吞蛋白的重组，进而诱导海马谷氨酸受体突触可塑性。Prokai[35]等也基于此技术鉴定了吗啡诱导大鼠前额皮质突触膜蛋白的变化。近期药物成瘾蛋白质组学的研究很少使用此技术进行定量分析。ICAT标记的效率具有时间依赖性，且只能标记半胱氨酸或其巯基被修饰的蛋白质，标记效率很少能达到80%以上，轻、重试剂标记的多肽有可能在不同的时间洗脱，所以其相对定量结果可能出现假阳性[41]。

3.4 iTRAQ定量技术

iTRAQ定量技术通过4个或8个来源不同的相同蛋白质样品在一级质谱上表现相同，平衡基团在二级质谱中发生中性丢失，报告基团在二级质谱中产生4个或8个报告离子，分析报告离子峰的比值强度，及同一个蛋白质在不同样品间表达量的比值。该技术分析能力强、范围广，可用于低丰度、强碱性、相对分子质量小于10×103或大于200×103的蛋白质的检测，定量分析可靠[42]。Reissner[36]等基于此定量技术鉴定了可卡因诱导大鼠伏隔核突触后密集区蛋白质表达的变化，结果表明突触上的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）谷氨酸受体表面的GluR1差异表达，这些差异表达的蛋白质可能通过增加NAC上的AMPA受体的表达诱导可卡因的复吸。但iTRAQ技术样品预处理和酶解过程可能引起平行样品之间的差别，造成结果偏差，且成本较高。

4 结语

蛋白质组学能够动态分析细胞内变化蛋白质的组成、表达水平和生物功能，及参与的生物过程、蛋白质之间的相互作用和联系规律。蛋白质组学技术已广泛应用于生物医学各领域如肿瘤、癌症和致瘾性药物等研究中。反复接触致瘾性药物可以改变脑部特定区域蛋白质的表达水平或表达类型，新的蛋白质组学技术将逐渐应用于药物成瘾的研究。

从凝胶电泳到多维液相色谱的分离技术已应用于药物成瘾蛋白质组学的研究，鉴定出能量代谢、细胞组织结构、信号传导、突触和受体等相关的蛋白质。但实现神经组织中复杂全蛋白质样品的分离仍是当前研究的热点。高通量的多维液相色谱分离技术可以进一步实现对全蛋白质的深入分析。

分离技术的进步推动了质谱技术的快速发展，多标记、蛋白质覆盖率全的定量蛋白质组学技术的进步，也加快了新的质谱技术的发展。由傅立叶变换程序的计算机和磁场捕获离子的分析室组成的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪具有很高的分辨率（可达100万以上）和灵敏度。

高效快速的分离技术、多标记和覆盖率全的蛋白质定量技术结合高分辨率和灵敏度的质谱技术，有望提高药物成瘾蛋白质样品检测的通量、灵敏度及分辨率。筛选出调控成瘾的重要蛋白质，构建药物成瘾相关蛋白质的调控网络，对于理解药物成瘾的机制及寻找治疗药物成瘾的靶标具有重要的研究价值和实际意义。

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Application of Proteome Techniques in Drug Addiction Re⁃search

ZHU Bei-Bei,Li Xiang-Yu,CHEN Huan, ZHANG Sen,HOU Hong-Wei*,HU Qing-Yuan*
China National Tobacco Quality Supervision&Test Centre,Zhengzhou 450001,China

This paper briefly outlined the separation,identification and quantification proteomics technology and its application in research of addictive drugs like alcohol,nicotine,morphine,cocaine and methamphetamine.Pro⁃teomics is one of the powerful tools in the post-genomic era.With the development of protein separation,identifi⁃cation and quantitative technology,especially the liquid chromatography with wide application range and good sepa⁃ration efficiency and the mass spectrometry with high sensitivity,proteomics has been applied to drug addiction re⁃search more extensively,and will promote the understand of protein changes during the drug dependence formation and its participation in the biological process and related pathways,which will help to highlight molecular mecha⁃nisms underlying addiction.

proteomics;peparation and identification;quantitative proteomics;drug addiction

R964

A

1009-0002（2017）02-0207-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.028

2016-08-25

国家烟草专卖局重点项目（110201402037）

朱贝贝（1991-），女，硕士研究生

侯宏卫，（E-mail）qsfctc@163.com；胡清源，（E-mail）huqy1965@163.com

*Co-corresponding anthors,HOU Hong-Wei,E-mail:qsfctc@163.com;HU Qing-Yuan，E-mail:huqy1965@163.com