人PROKR2蛋白274位缬氨酸突变质粒的构建及表达

周晓涛，陈丹娜，刘化蝶，周文涛，彭震，戴雨亭，李家大

1.新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.中南大学 医学遗传学国家重点实验室，湖南 长沙 410000；3.新疆医科大学 第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011

人PROKR2蛋白274位缬氨酸突变质粒的构建及表达

周晓涛1，陈丹娜2，刘化蝶2，周文涛3，彭震2，戴雨亭2，李家大2

1.新疆医科大学 基础医学院免疫学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.中南大学 医学遗传学国家重点实验室，湖南 长沙 410000；3.新疆医科大学 第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011

目的：构建人前动力蛋白受体2（hPROKR2）274位缬氨酸残基突变的真核表达质粒pKR5-mGlu-FlaghPROKR2（V274D或V274R或V274T或V274A），并观察其蛋白表达。方法：将pKR5-mGlu-Flag-mPKR2质粒和PCR扩增的hPROKR2编码序列用MluⅠ、XbaⅠ酶切后连接，构建pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2质粒；以后者为模板，利用定点突变技术分别构建pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表达质粒；用West⁃ern印迹验证Flag-hPROKR2（V274D）、（V274A）、（V274T）、（V274R）在真核细胞中的表达。结果：构建了pKR5-mG⁃lu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表达质粒，并观察到相应的蛋白表达。结论：pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）、（V274R）、（V274T）、（V274A）真核表达质粒的构建，为后期检测第274位缬氨酸对hPROKR2蛋白分子空间结构及功能的影响创造了条件。

人前动力蛋白受体2；定点突变；缬氨酸

人前动力蛋白受体2（human prokineticin re⁃ceptor 2，hPROKR2）基因位于染色体20p12.3，mRNA全长2242 bp，编码384个氨基酸残基。hPROKR2属于G蛋白偶联受体，与相应配体前动力蛋白（prokinticin，PK）结合后，参与平滑肌收缩、血管发生及促胚胎期神经元发育和迁移[1-2]。基因型研究显示，PK2和hPROKR2的突变与卡尔曼综合征（Kallmann syndrome，KS）和/或特发性（单纯性）促性腺激素型性腺功能减退（isolated hypogonadotropic hypogonadism，IHH）发病有关，表现为青春期延迟和不孕[3-5]。Sinisi等在一个KS合并性腺功能减退患者身上发现了hPROKR2基因的同源V274D突变[6]。先证者的母亲为异源V274D突变，仅仅表现为月经初潮延迟（15岁）并伴有规律的月经周期[23]。突变的第274位缬氨酸（Val，V）位于PROKR2第三内环（IL3）和第6跨膜区（TM6）之间连接处，这也是与许多G蛋白偶联受体活化有关的重要区域。为了进一步研究hPROKR2的第274位氨基酸在该受体信号传导中的作用，需要构建一系列hPROKR2第274位氨基酸突变的质粒。在此，我们构建了hPROKR2基因274位缬氨酸密码子突变质粒，并验证了其表达，为进一步研究hPROKR2第274位缬氨酸对该受体的功能提供了条件。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH10B由中南大学医学遗传学国家重点实验室提供；鼠源PROKR2（mPROKR2）质粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2由法国蒙彼利埃大学Philippe Rondard教授惠赠；pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his由本实验室储备；DL2000 DNA marker、限制性内切酶DpnⅠ购自NEB公司；Phusion高保真酶购自Thermo Scientific公司；Plasmid Mini KitⅠ柱式质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司；Nu⁃cleoSpin Gel and PCR Clean-up胶回收试剂盒购自Macherey-Nagel公司；LB液体和固体培养基、氨苄西林等试剂购自Sigma公司；LipofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；鼠单克隆M2抗Flag抗体购自Sigma公司；预染蛋白分子marker购自Thermo Scientific Pierce公司；培养基及耗材购自GIBCO公司。

1.2 引物设计与合成

根据已报道的hPROKR2基因序列（NCBI序列号：NM_144773），利用在线软件QuikChange Primer Design Program（https://www.genomics.agilent. com）设计扩增突变质粒引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成（PAGE纯化）。

1.3 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2质粒的构建

以pcDNA3.1-hPROKR2-myc-his为模板，用引物hPROKR2F和hPROKR2R扩增出1169 bp的hPROKR2片段，回收后用1 μL MluⅠ于37℃酶切过夜，酶切产物经凝胶电泳回收，用1 μL XbaⅠ于37℃酶切2 h，再将酶切产物电泳回收，与经同样酶切的pKR5-mGlu-Flag-mPKR2质粒连接，形成质粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2。PCR反应体系包括5 μL 10×HF反应缓冲液，0.5 μL dNTP混合物（10 mmol/L），0.5 μL Phusion聚合酶，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），5 μL模板（20 ng/μL），加ddH2O至总体积25 μL。反应条件：98℃预变性30 s；98℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃90 s，25个循环；72℃延伸7 min。用相应的DNA内切酶双酶切目的基因和质粒后，经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH10B，37℃培养过夜。经氨苄西林抗性标记筛选得到阳性克隆，酶切鉴定后送上海Sangon公司测序，用DNAstar软件及GenBank/Blast在线工具对测序结果进行分析。

表1 引物及序列

1.4 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2突变质粒的构建

以pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2质粒为模板，用 不 同 的 hPROKR2（V274D、V274A、V274T、V274R）突变引物进行PCR扩增。PCR反应体系包括5 μL 10×HF反应缓冲液，0.5 μL dNTP混合物（10 mmol/L），0.5 μL Phusion聚合酶，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），5 μL模板（20 ng/ μL），加ddH2O至总体积25 μL。反应条件：98℃预变性30 s；98℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 5 min 25个循环；72℃延伸6 min。对照组不加引物。在25 μL PCR产物中加入1 μL DpnⅠ限制性内切酶，37℃消化过夜。取10 μL质粒转化50 μL大肠杆菌DH10B感受态细胞（冰上2 min，42℃热激90 s，再放置冰上2 min），用500 μL LB培养液于37℃、280 r/min振荡培养45 min，再取200 μL菌液涂板，37℃培养过夜，在含氨苄西林（100 μg/mL）的固体平板培养基上挑取单克隆菌落培养，提取重组质粒，测序鉴定hPROKR2基因第274位缬氨酸是否分别被突变为丙氨酸（Ala，A）、天冬氨酸（Asp，D）、苏氨酸（Thr，T）和精氨酸（Arg，R）。

1.5 Werstern印迹验证Flag-hPROKR2（V274D、V274A、V274T、V274R）蛋白的表达

将以3×105293T细胞传至6孔板中，待次日细胞增殖融合达 70%左右，用 LipofectAMINE 2000分别转染2 μg质粒Flag-hPROKR2及2 μg Flag-hPROKR2（V274）突变质粒，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃去细胞培养上清，用PBS洗涤1次，加入100 μL完全细胞裂解液，95℃变性10 min，取20 μL上清，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃作用5 min变性，用10%SDSPAGE使蛋白分离，再经290 mA电流湿转90 min至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉/TBST封闭1 h，加Flag抗体（1∶1000，鼠源）孵育2 h，TBST洗3次，加小鼠抗体（1∶10000）孵育1 h，TBST洗3次，ECL显色，保存结果。

2 结果

2.1 质粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2的构建

PCR扩增的hPROKR2片段长1169 bp，质粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2和 pKR5-mGlu-FlaghPROKR2经MluⅠ和XbaⅠ酶切后分别可见1146 bp的mPKR2（NM_144944）和1155 bp的hPROKR2（图1）。经NCBI的Blast比对，pKR5-mGlu-FlaghPROKR2测序结果完全符合，图1C仅显示hPROKR2第274位缬氨酸附近的碱基序列。

2.2 突 变 质 粒 pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D，V274R，V274T，V274A）的构建

经DpnⅠ酶切后的PCR产物转化大肠杆菌DH10B后培养过夜，阴性对照无克隆出现，突变质粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D）出现30个克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274R）出现25个克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274A）出现 18个克隆，pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274T）出现20个克隆。提取克隆，扩增后测序。从图2测序结果可以看出，编码hPROKR2第274位缬氨酸的碱基GTC已分别被突变为GAC（天冬氨酸密码子）、CGC（精氨酸密码子）、GCC（丙氨酸密码子）和ACC（苏氨酸密码子）。

2.3 突变蛋白Flag-hPROKR2（V274D，V274R，V274A，V274T）的表达

将各突变质粒转化293T细胞，提取细胞全蛋白，通过蛋白标签Flag抗体检测，可以看出蛋白都能正常表达，相对分子质量大于250×103，并且条带弥散，跨度较大（图3）。

3 讨论

前动力蛋白PK1与PK2富含半胱氨酸，相对分子质粒约 10×103[7]，是 PROKR（PROKR1与PROKR2）的配体。PROKR与其相应配体结合后，可通过活化下游多种信号途径参与机体的很多生物学功能，如血管发生、神经生成、昼夜节律、情绪、痛觉、胃肠道运动和摄食等[7-15]。KS和/或IHH是指下丘脑促性腺激素释放素（GnRH）合成分泌缺陷致使垂体单纯性促性腺激素分泌不足所引起的性腺功能减退，表现为青春期延迟和不孕[3-5]。遗传学研究显示PK2与PROKR2的突变与KS和/或IHH有关，疾病相关的PROKR2突变可表现为受体上膜障碍，与相应配体PK2结合障碍或与下游G蛋白偶联障碍[16-17]。

图1 质粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2的构建

图2 突变质粒的测序结果（局部）

图3 Werstern印迹检测hPROKR2不同突变蛋白的表达

PROKR2属于G蛋白偶联受体，其结构包括7次跨膜螺旋、3个胞内环（IL1～3）和1个胞内C端。正确的分子结构对于G蛋白偶联受体通过内质网-高尔基体途径转运至细胞膜的过程非常重要，而跨膜区的很多突变可导致蛋白错误折叠，不成熟的受体蛋白会停滞在内质网中。PROKR2第274位缬氨酸位于其第三内环（IL3）与第六跨膜区（TM6）之间的连接处，该处也是许多G蛋白偶联受体活化的重要区域。由于先证者表现为KS合并性腺功能减退，并且其hPROKR2基因出现同源V274D突变。为此，我们尝试将274位缬氨酸突变为天冬氨酸，以便观察hPROKR2（V274D）蛋白的功能改变。考虑到氨基酸的酸碱性及携带的电荷有可能影响蛋白肽链局部的空间结构，进一步构建hPROKR2（V274R），因为精氨酸为极性带负电荷氨基酸，由此来判断电荷对PROKR2空间结构及功能的影响。随后我们进一步构建hPROKR2（V274T），而苏氨酸为极性不带电荷氨基酸，以此考察蛋白分子极性对PROKR2空间结构及功能的影响。

研究突变蛋白的分子生物学功能，首先要构建一个真核表达质粒。在本课题中，我们以法国蒙彼利埃大学Philippe Rondard教授惠赠的质粒pKR5-mGlu-Flag-mPKR2作为骨架质粒，利用引物扩增出hPROKR2，经限制性内切酶切出粘性末端，用DNA连接酶连入骨架质粒。在分子生物学实验中，由于酶切效率以及酶切用缓冲液的缘故，双酶切往往会出现酶切不尽的情况，会影响后期的连接。在本实验中，用限制性内切酶MluⅠ和XbaⅠ同时进行酶切时效率很低，我们采用的是依次单酶切的方法，即用MluⅠ单酶切过夜，保证质粒尽可能被切成线性，线性质粒经琼脂糖电泳后出现的条带通过切胶方式回收纯化，再用XbaⅠ进行第二次单酶切，XbaⅠ酶切效率很高，37℃酶切2 h后将酶切产物进行琼脂糖电泳，切胶回收，酶切后的骨架质粒与PCR产物连接，转化载体后振荡培养扩增。在对突变克隆的鉴定中，因为限制性内切酶MluⅠ和XbaⅠ同时酶切的效率很低，此时鉴定方式也采取了单酶切鉴定法，我们选取目的基因构入时消失的限制性内切酶位点进行鉴定，如果不能将环形质粒切成线性，即表示质粒中已连入目的基因。

定点突变技术非常适合用于氨基酸突变对蛋白功能影响的研究。其基本原理是以从大肠杆菌中纯化抽提出的质粒为模板，设计一对包含突变位点的引物和模板质粒退火后用Phusion高保真酶循环延伸，延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。由于来源于大肠杆菌的模板质粒是经Dam甲基化修饰的，而体外新合成的带突变序列的质粒没有被甲基化，故用限制性内切酶DpnⅠ对延伸产物进行酶切，则模板质粒因为对DpnⅠ敏感而被切碎，新合成的质粒在随后的转化培养过程中缺口被修复，从而得到实验所需的突变质粒。从单点突变的原理上可看出有几个需要注意的地方：①因为普通PCR中会出现点突变，在实验中需要保证在完整质粒的扩增中除了设计的突变位点外不能再发生其他突变，这就需要使用高保真酶进行扩增，我们使用的是Ther⁃mo Scientific公司的Phusion高保真酶。②需要采用低次数的循环延伸而非常规PCR，有助于减少无意错配。使用质粒作为PCR的模板利于目的基因的特异性扩增，在实验中模板起始浓度为20 ng/μL，循坏次数为25个。③要保证模板质粒尽可能被DpnⅠ切碎切尽，通常需要做阴性对照来对实验过程及结果进行质控，阴性对照PCR体系中只放模板质粒，不放引物，其余过程相同，经DpnⅠ酶切后进行转化，理想情况为在选择性平皿上应该没有克隆长出，以此来判定DpnⅠ酶切效果是否完全彻底。

为了进一步观察第274位缬氨酸在hPROKR2蛋白功能中的意义，验证不同突变蛋白能否正常表达尤为重要。通过Uniprot查找，hPROKR2蛋白相对分子质量为43.996×103，但由于hPROKR2能够被糖基化，所以其相对分子质量往往大于250× 103。在本实验中，我们采用免疫印迹方法对真核细胞中表达的各类突变蛋白进行了鉴定，结果显示均能正常表达。

综上所述，我们构建了真核表达质粒pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2，并进一步构建了hPROKR2第274位缬氨酸分别突变为天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸和苏氨酸的表达质粒，检测到它们均能正常表达，为下一步研究第274位缬氨酸对hPROKR2蛋白分子空间结构及功能的影响提供了前提。

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Construction and Expression of the pKR5-mGlu-FlaghPROKR2（V274D/R/T/A）

ZHOU Xiao-Tao1,CHEN Dan-Na2,LIU Hua-Die2, ZHOU Wen-Tao3,PENG Zhen2,DAI Yu-Ting2,LI Jia-Da2*
1.Basic Medical College in Xinjiang Medical University,Urumqi 830011;2.State Key Laboratory of Medical Ge⁃netics of Centralsouth University,Changsha 410000;3.Department of Traditional Chinese Medicine,Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830000;China

Objective:To construct eukaryotic expression plasmid pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）and verify their expression.Methods:The coding sequence of hPROKR2 was amplified by PCR and digested by XbaⅠ and MluⅠ,and was inserted into the same enzyeme cutting pKR5-mGlu-Flag-mPKR2 to construct pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2.The eukaryotic expression plasmid pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）were ob⁃tained by the site directed mutagenesis technique.The expression of Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）protein was verified by Werstern blot.Results:The four resulting plasmids were confirmed by DNA sequencing and the corre⁃sponding protein was expressed with the Mrover 250×103.Conclusion:The pKR5-mGlu-Flag-hPROKR2（V274D/R/T/A）have been consturcted and they will be used in the research of the effects of 274 valine on the spatial structure and function of hPROKR2 protein.

human prokineticin receptor 2;site directed mutagenesis;valine

Q78

A

1009-0002（2017）02-0090-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.004

2016-10-31

国家自然科学基金（31401218）；新疆维吾尔自治区自然科学基金（2015211C034）

周晓涛（1981-），女，副教授，博士

李家大，（E-mail）lijiada@sklmg.edu.cn

*Corresponding anthor,E-mail:lijiada@sklmg.edu.cn