丹参酮Ⅰ通过诱导凋亡抑制HepG2细胞生长

张英，庞博，郑利华，黄芳，王健，王芃，刘贵建，李山虎

1.中国中医科学院 广安门医院检验科，北京 100053；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

丹参酮Ⅰ通过诱导凋亡抑制HepG2细胞生长

张英1，2，庞博1，郑利华1，黄芳2，王健2，王芃2，刘贵建1，李山虎2

1.中国中医科学院 广安门医院检验科，北京 100053；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

目的：研究丹参酮Ⅰ对肝癌细胞HepG2生长的影响。方法：MTT法检测丹参酮Ⅰ对HepG2细胞增殖的影响，Western印迹检测经丹参酮Ⅰ处理的HepG2细胞中凋亡标志物c-Parp和周期蛋白D1的表达变化，流式细胞术检测细胞的凋亡及周期分布。结果：MTT分析发现丹参酮Ⅰ可抑制HepG2细胞的生长；经丹参酮Ⅰ处理的HepG2细胞中凋亡标志物c-Parp表达升高，周期蛋白D1表达无明显变化；流式细胞术分析结果进一步证明丹参酮Ⅰ可诱导HepG2细胞发生凋亡，对细胞周期分布无明显影响。结论：丹参酮Ⅰ通过诱导细胞凋亡而抑制HepG2细胞的生长，对细胞周期无明显阻滞，为进一步研究丹参酮Ⅰ的抗肿瘤作用分子机制提供了线索。

丹参酮Ⅰ；HepG2细胞；周期；凋亡

丹参（Savia miltiorrhiza）是常用传统中药，功擅活血化瘀，其主要化学成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类。丹参酮Ⅰ（tanshinoneⅠ，T1）是从丹参中分离提取的一种脂溶性红色结晶（图1），近年发现其能抑制STAT-3和AKT/ mTOR信号通路，抑制淋巴细胞白血病细胞P338和乳腺癌细胞MDA-MB-453、MCF-7的生长[1-2]，但其抑制肿瘤细胞生长的具体机制仍不清楚。为了进一步研究T1的抗肿瘤作用，为丹参的抗肿瘤临床应用提供更广泛的依据，我们初步探讨了T1对肝癌细胞HepG2生长、周期和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

丹参酮Ⅰ购自北京盈泽纳新化工技术研究院；人肝癌细胞HepG2为本实验室保存；DMEM细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT粉末购自Sigma公司；c-Parp、周期蛋白D1抗体购自CST公司；细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购自凯基公司。

1.2 MTT分析

将HepG2细胞按3000/孔接种于96孔板，经T1处理后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后吸尽培养液，按150 μL/孔加入DMSO，充分吹打混匀，用酶标仪检测D570nm值。将对照组设为1，处理组与对照组的比值即为相对细胞增殖率。每次实验设3个复孔，独立实验重复3次。

1.3 Western印迹

将HepG2细胞培养在100 mm培养皿中，待细胞长至80%加T1（10 μmol/L）处理，提取细胞蛋白，经10%SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，封闭后加入一抗，4℃轻摇孵育48 h，用TBST洗膜3次，加入二抗，4℃轻摇孵育24 h，用TBST洗膜3次，滴加化学发光液，暗室胶片显像。

1.4 流式细胞术检测细胞周期和凋亡

用10 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24和48 h，PBS洗2次，用75%冷乙醇于-20℃固定，2000 r/min离心3 min后加入25 mg/L RNase和50 mg/L PI，避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布，用Modifit LT软件分析数据。

凋亡检测按凋亡试剂盒说明书进行。用1 mL 1×上样缓冲液悬浮细胞，300 RCF离心10 min后弃上清；用适量的1×上样缓冲液调细胞浓度为1×106/mL，取100 μL细胞液加入5 μL An⁃nexinⅤ-FITC，轻轻振荡混匀，室温避光孵育10 min；加入5 μL PI试剂，室温避光孵育5 min；最后加PBS到500 μL，轻轻混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Modifit LT软件分析数据。

图1 丹参酮Ⅰ的化学分子结构

2 结果

2.1 丹参酮Ⅰ抑制HepG2细胞的生长

分别用 0、2、4、6、8、10 μmol/L T1处理HepG2细胞48 h，MTT法检测细胞存活率（存活率=加药组D570nm值/对照组D570nm值）。结果显示，T1浓度为8 μmol/L时对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用，抑制率达67.4%，并且随着T1浓度的增加抑制作用增强（图2）。用8 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24、48、72 h，T1对HepG2细胞增殖的抑制率（抑制率=1-存活率）随时间的延长而上升（图3）。

图2 不同浓度T1对HepG2细胞生长的影响

图3 T1处理不同时间对HepG2细胞生长的影响

2.2 丹参酮Ⅰ诱导HepG2细胞发生凋亡

用10 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24和48 h，Western印迹检测细胞中凋亡标志物c-Parp的表达。结果表明，T1处理能使c-Parp蛋白表达明显升高，提示T1能够诱导HepG2细胞发生凋亡（图4）。

用10 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24和48 h，与不加T1处理的对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡的细胞均明显增多，早期凋亡率和晚期凋亡率平均值分别为4.36%和6.04%，证明T1可诱导HepG2细胞发生凋亡（图5、6）。

2.3 丹参酮Ⅰ对HepG2细胞周期分布无明显阻滞作用

为了探究T1是否影响HepG2细胞的周期分布，用10 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24和48 h，Western印迹检测细胞中周期蛋白D1的表达。结果表明，T1处理的HepG2细胞周期蛋白D1的表达没有明显变化，提示T1对HepG2细胞的周期分布没有明显影响（图7）。

用10 μmol/L T1分别处理HepG2细胞24和48 h，检测发现G1、G2、S各期细胞分布与不加T1处理的对照组相比没有显著差异，G2/G1期细胞比例依次为1.92（对照组）、1.92（T1处理24 h）和1.93（T1处理48 h），各组差异不具有统计学意义，证明T1对HepG2细胞的周期分布没有显著影响（图8、9）。

图4 T1处理HepG2细胞的c-Parp蛋白表达

图5 T1处理HepG2细胞的凋亡率

图6 流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测HepG2细胞凋亡

3 讨论

中医理论中，活血化瘀是治疗癌症的主要方法之一。丹参作为常用的活血化瘀中药，具有抗肿瘤作用，已被用于肝癌、胃癌、白血病等多种肿瘤的治疗[3]。近年来研究表明丹参酮是丹参抗肿瘤的主要活性成分，对肿瘤细胞有直接的杀伤作用[4-5]。目前，在对众多丹参抗肿瘤成分的研究中，关于丹参酮Ⅰ抗肿瘤的报道较少。有研究提示，与抗肿瘤作用研究最为广泛和深入的丹参酮ⅡA相比，丹参酮Ⅰ具有更强的药效，值得深入探讨[6]。我们的研究表明丹参酮Ⅰ通过诱导HepG2细胞发生凋亡，显著抑制HepG2细胞的生长增殖。我们检测了经丹参酮Ⅰ处理的HepG2细胞周期，发现与肿瘤关系最为密切、能够促进细胞周期转换速度、导致细胞增殖失控而发生癌变的周期蛋白D1的表达没有明显变化，证明丹参酮Ⅰ对HepG2细胞的周期分布无显著影响。我们的研究结果证明，丹参酮Ⅰ抑制HepG2细胞生长增殖作用的机制与阻滞细胞周期无关，是通过诱导HepG2细胞发生凋亡和其他未知途径如自噬等实现的，这为丹参酮Ⅰ抑制肿瘤细胞生长的分子机制研究提供了重要线索。同时，我们证明了丹参酮Ⅰ是丹参中有效的抗肿瘤活性成分之一，为丹参用于临床治疗肿瘤提供了依据。

图7 T1处理HepG2细胞的周期蛋白D1的表达

图8 T1处理后HepG2细胞周期分布变化

图9 流式细胞术检测T1处理后HepG2细胞的周期分布

[1]Li H,Zhang Q,Chu T,et al.Growth inhibitory and apoptosis inducing effects of tanshinones on hematolog⁃ical malignancy cells and their structure activity rela⁃tionship[J].Anticancer Drug,2012,23(8):846-855.

[2]Wang Yan,Li Jia-Xin,Wang Ying-Qing,et al.Tan⁃shinone I inhibits tumor angiogenesis by reducing STAT3 phosphorylation atTYR705 and hypoxia-in⁃ duced HIF-1αaccumulation in both endothelial and tu⁃mor cells[J].Oncotarget,2015,6(18):16031-16042.

[3]张民庆,龚惠明.抗肿瘤中药的临床应用[M].北京:人民卫生出版社,1998:256-258.

[4]陈坚,林庚金.丹参酮抗肿瘤的研究进展[J].复旦学报（医学版）,2003,30(6):626-628.

[5]张伟伟,陆茵.丹参抗肿瘤活性成分研究新进展[J].中国中药杂志,2010,35(3):389-382.

[6]郝文慧,赵文文,陈修平.丹参酮类抗肿瘤作用与机制研究进展[J].中国药理学通报,2014,30(8):1041-1044.

TanshinoneⅠInhibits the Growth of HepG2 Cells by Induc⁃ing Apoptosis

ZHANG Ying1,2,PANG Bo1,ZHENG Li-Hua1,HUANG Fang2, WANG Jian2,WANG Peng2,LIU Gui-Jian1*,LI Shan-Hu2*
1.Clinical Laboratories,Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To study the influence of TanshinoneⅠon HepG2 cells proliferation,cell cycle and cell apoptosis.Methods:The proliferation of cells was detected by MTT assay.Western blotting was used to detect the c-Parp and cyclin D1.The cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometer.Results:MTT re⁃sults showed that tanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells.Western blotting proved that tanshinoneⅠcan make the apoptosis marker c-Parp increase in HepG2 cells,but didn't change cyclin D1.Flow cytometry results showed that tanshinoneⅠcan induce apoptosis of HepG2 cells and had no effect on the cycle distribution.Conclu⁃sion:TanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells by inducing apoptosis,which provided a clue for further study on the molecular mechanism of anti-tumor action of tanshinoneⅠ.

tanshinoneⅠ;HepG2 cells;cell cycle;cell apoptosis

Q25

A

1009-0002（2017）02-0105-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.007

2016-11-17

国家自然科学基金（81470138，81372770，81372140）

张英（1989-），女，硕士研究生

李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com；刘贵建，（E-mail）liuguijian@hotmail.com

*Co-corresponding anthors,LI Shan-Hu,E-mail:lishahuhu6@163.com;LIU Gui-Jian,E-mail:liuguijian@hotmail.com