人转录因子激活蛋白TFAP2γ促进乳腺癌细胞生长

尤文叶，徐小洁，梁迎春，张立，闫志风，叶棋浓，李瑛，杨俊兰

1.解放军总医院 肿瘤内科，北京 100853；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017；4.解放军总医院 妇产科，北京 100853

人转录因子激活蛋白TFAP2γ促进乳腺癌细胞生长

尤文叶1，徐小洁2，梁迎春2，张立3，闫志风4，叶棋浓2，李瑛1，杨俊兰1

1.解放军总医院 肿瘤内科，北京 100853；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017；4.解放军总医院 妇产科，北京 100853

目的：构建带Flag标签的人转录因子激活蛋白2γ（TFAP2γ）基因真核表达载体，获得Flag-TFAP2γ蛋白，检测其对乳腺癌细胞生长的影响。方法：采用PCR技术从乳腺文库中扩增出人TFAP2γ基因，并将其正确插入Flag载体；将重组质粒与空载体转染人乳腺癌细胞系ZR75-1和MCF-7细胞后，Western印迹检测表达情况，并进行生长曲线实验。结果：双酶切和测序鉴定表明，Flag-TFAP2γ真核表达质粒构建成功，转染ZR75-1和MCF-7细胞后获得表达；生长曲线实验结果表明，TFAP2γ可促进乳腺癌细胞的生长。结论：构建了带Flag标签的人TFAP2γ基因真核表达载体，并能在乳腺癌细胞ZR75-1和MCF-7中表达，且能促进细胞的生长。本实验为进一步研究TFAP2γ在乳腺癌中的功能奠定了基础。

人转录因子激活蛋白2γ；克隆；真核表达

转录因子激活蛋白2γ（transcription factor ac⁃tivator protein 2 gamma，TFAP2γ）是转录因子激活蛋白2家族的重要成员，是转录过程中的重要调控因子，参与EGFR[1]、RET[2]、CDKN1A[3]、Wwox[4]等多种下游靶基因的表达。研究发现，TFAP2γ可调控雌激素受体α（ERα）的表达，并参与乳腺癌发育、分化和肿瘤形成[5]。为了深入了解TFAP2γ在乳腺癌中的功能，我们从人乳腺文库中扩增出TFAP2γ基因的全长编码序列，构建在带Flag标签的真核表达载体上，通过生长曲线实验验证该真核表达载体能促进乳腺癌细胞的生长，为今后研究TFAP2γ在乳腺癌中的功能奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人ZR75-1、MCF-7细胞由本实验室传代培养；乳腺文库和Flag载体为本室保存；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收、PCR回收试剂盒购自Promega公司；DMEM及小牛血清均购自Gibco公司；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 Flag-TFAP2γ重组质粒的构建与测序

根据文献报道的人TFAP2γ基因序列设计上游引物（5'-CGGGATCCTAATGTCAAGTACGAAGA GG-3'）和下游引物（5'-ATAAGAATGCGGCCGCT TATTTCCTGTGTTTCTCCA-3'），上游引物含BamHⅠ酶切位点，下游引物含NotⅠ酶切位点。以人乳腺文库为模板，PCR扩增目的片段（扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行31个循环；72℃再延长7 min），用胶回收试剂盒回收PCR产物。

用BamHⅠ和NotⅠ双酶切Flag载体，10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCR片段回收后再用BamHⅠ和NotⅠ酶切，形成带有粘端的末端，用T4DNA连接酶连接入Flag载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，培养并提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.3 乳腺癌细胞系转染

用含双抗、100 mL/L小牛血清的DMEM培养基将ZR75-1细胞接种于6 cm皿中，接种量以转染时细胞密度达80%为宜，培养24 h后进行转染，转染前1 h换液。将4 μL VigoFect与200 μL NaCl混合，再将总量为10 μg的重组质粒与200 μL NaCl混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入6 cm皿，并以同样方法转染空Flag载体作为对照，37℃、5%CO2常规培养，4～6 h后换液。

1.4 Western印迹检测

质粒转染ZR75-1和MCF-7细胞24 h后收集细胞蛋白，加入2×SDS加样缓冲液，煮沸10 min，高速离心2 min，取上清液进行SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，加入用5%脱脂奶粉以1∶5000稀释的用HRP标记的抗Flag标签鼠单克隆抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化学发光法显色5 min，压片显影。

1.5 生长曲线

将Flag-TFAP2γ和空载体分别转染ZR75-1和MCF-7细胞，48 h后取处于对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后稀释至2×104/孔，分别接种于5个96孔板，各设3个重复孔，常规培养。每日取一块96孔板，在接种孔内用排枪加入CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，测定D450nm值。

2 结果

2.1 Flag-TFAP2γ重组质粒的构建与鉴定

以实验室保存的乳腺文库为模板，PCR扩增人TFAP2γ的编码序列，获得长约1330 bp的DNA片段，与预期片段大小一致（图1）。将PCR产物用BamHⅠ和NotⅠ双酶切后，与经同样双酶切的Flag载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，进行菌液PCR鉴定。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定可切出1330 bp的条带，而相应的空载体酶切只见大片段，符合预期结果（图2）。测序结果表明，插入片段的DNA序列与人TFAP2γ基因的编码序列完全一致（数据略）。

2.2 Western印迹检测Flag-TFAP2γ在乳腺癌细胞中的表达

将构建的Flag-TFAP2γ重组质粒转染ZR75-1和MCF-7细胞系，24 h后提取蛋白进行SDSPAGE，Western印迹检测Flag-TFAP2γ蛋白的表达。结果显示，用Flag-HRP抗体可在相对分子质量约60×103处检测到明显的特异性条带，说明Flag-TFAP2γ重组蛋白在ZR75-1和MCF-7细胞中能够正确表达，而空载体无表达（图3）。

2.3 生长曲线实验验证TFAP2γ促进ZR75-1和MCF-7细胞生长的功能

为了验证TFAP2γ的功能，将真核表达载体Flag-TFAP2γ及空载体分别转染ZR75-1和MCF-7细胞后进行生长曲线实验，结果证明TFAP2γ能促进ZR75-1和MCF-7细胞的生长（图4）。

图1 PCR扩增人TFAP2γ的编码序列

图2 重组质粒Flag-TFAP2γ的BamHⅠ/NotⅠ双酶切电泳图谱

3 讨论

激活蛋白2转录家族中的5个成员包括TFAP2α、TFAP2β、TFAP2γ、TFAP2δ和TFAP2ε，在调节脊椎动物细胞增殖、分化、凋亡，胚胎发育，肿瘤形成等生物学过程中发挥着重要功能[6]。其中，TFAP2γ由TFAP2C基因编码，在结直肠癌[7]、卵巢癌[8]、肾癌[9]、黑色素瘤[10]等多种肿瘤中表达升高，而在乳腺癌中尤甚。

图3 Western印迹检测蛋白表达

图4 TFAP2γ促进乳腺癌细胞生长

TFAP2γ在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要的作用[11-13]。TFAP2γ通过多个雌激素信号通路，调节乳腺癌细胞对内分泌治疗的敏感性。Woodfield等[14]发现乳腺癌中TFAP2γ只在细胞核内表达，高表达与生存期缩短显著相关，是内分泌治疗耐药和预后差的独立预测因子。Perkins等[15]发现，在初次诊断超过10年的乳腺癌患者中，TFAP2γ的表达与总生存OS相关，尤其在ER阳性和内分泌治疗阳性的亚组更明显。Span⁃heimer等[2]发现，在ER阳性的MCF-7细胞和ER阴性的MDA-MB-453细胞敲低TFAP2γ都能引起RET mRNA显著下调，TFAP2γ通过RET启动子的5个AP2调节位点调节原癌基因RET的表达，TFAP2γ在乳腺癌中调节RET的表达可能依赖于ER。TFAP2γ可促进乳腺上皮细胞的增殖，Wil⁃liams等[3]发现TFAP2γ与CDKN1A的近端启动子在功能上有直接的相关性，可通过直接抑制CD⁃KN1A基因促进乳腺癌细胞的增殖，导致了内分泌治疗的失败。

本研究构建了质粒Flag-TFAP2γ，并在乳腺癌细胞系ZR75-1和MCF-7中过表达TFAP2γ，有助于进一步探讨TFAP2γ在乳腺癌中的生物学功能。通过检测细胞生长曲线发现，过表达TFAP2γ能显著升高乳腺癌细胞系ZR75-1和MCF-7的细胞增殖能力，提示TFAP2γ在乳腺癌的发生发展中可能扮演着癌基因的角色。本研究构建的TFAP2γ基因真核表达载体，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的分子生物学机制奠定了基础。

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Human Transcription Factor TFAP2γ Promotes Breast Can⁃cer Cell Proliferation

YOU Wen-Ye1,XU Xiao-Jie2,LIANG Ying-Chu2,ZHANG Li3, YAN Zhi-Feng4,YE Qi-Nong2*,LI Ying1*,YANG Jun-Lan1*
1.Department of Medical Oncology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;2.Beijing Institute of Biotech⁃nology,Beijing 100850;3.Department of Guard Bureau,Chinese PLA General Staff,Beijing 100017;4.Depart⁃ment of Obstetrics and Gynecology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;China

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of human transcription factor activator pro⁃tein 2 gamma（TFAP2γ）gene labelled with FLAG tag and detect its activity.Methods:Human TFAP2γ coding re⁃gion was amplified from human mammary cDNA library by PCR and cloned into FLAG vector.Human ZR75-1 cells and MCF-7 cells were transfected with the recombinant plasmid FLAG-TFAP2γ and the expression was de⁃tected by Western blotting.The growth curves of the breast cancer cells transfected with FLAG-TFAP2γ and emp⁃ty vector were performed to analyze the effect of TFAP2γ on breast cancer cell proliferation.Results:TFAP2γ eu⁃karyotic expression vector labeled with FLAG was verified by double digestion and DNA sequencing.Human TFAP2γ protein was expressed in human ZR75-1 cells and MCF-7 cells as was shown by Western blotting.ZR75-1 cells and MCF-7 cells transfected with FLAG-TFAP2γ grew faster than those transfected with empty vector.Conclusion:FLAG-TFAP2γ promotes proliferation of ZR75-1 cells and MCF-7 cells.The whole work laid the foundation for the further study on TFAP2γ function in breast cancer.

human transcription factor activator protein 2 gamma（TFAP2γ）;cloning;eukaryotic expression

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）02-0101-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.006

2016-11-10

国家自然科学基金（81472589，81672602，81572597，81502264）；吴阶平医学基金（320.6752.1230）；北京市科技新星计划（Z141102001814055）

尤文叶（1990-），女，硕士研究生；徐小洁（1982-），女，副研究员；梁迎春（1979-），女，在站博士后；同为第一作者

杨俊兰，（E-mail）yangjunlan301@sina.cn；李瑛，（E-mail）liying3012015@163.com；叶棋浓，（E-mail）yeqn66@yahoo.com

Co-corresponding authors,YANG Jun-Lan,E-mail:yangjunlan301@sina.cn;LI Ying,E-mail:liying3012015@163.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com