过表达Rab27A基因对胃癌细胞BGC823生物学行为的影响

王倩，杨静文，王飞飞，王如良，李光辉,肖文华

解放军总医院第一附属医院 肿瘤内科，北京 100037

过表达Rab27A基因对胃癌细胞BGC823生物学行为的影响

王倩，杨静文，王飞飞，王如良，李光辉,肖文华

解放军总医院第一附属医院 肿瘤内科，北京 100037

目的：研究Rab27A与胃癌细胞恶性生物学行为的关系。方法：以Rab27A低表达的胃癌细胞BGC823为出发细胞株，构建Rab27A过表达稳定细胞株，通过MTT实验、软琼脂集落形成实验、Transwell迁移和侵袭实验，观察过表达Rab27A后BGC823细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为的改变。结果：过表达Rab27A后，BGC823细胞的迁移（P＜0.05）和侵袭能力（P＜0.05）显著降低，但细胞增殖能力没有明显变化（P＞0.05）。结论：Rab27A在胃癌细胞发生发展过程中可能作为抑癌基因发挥作用，这一结果为胃癌的临床治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点。

Rab27A；胃癌；增殖；迁移；侵袭

胃癌是比较常见的消化系统恶性肿瘤。虽然在过去50年里胃癌的发病率有所下降，并且，近些年在胃癌的临床早期诊断、手术治疗、围手术期护理方面取得的进步在一定程度上改善了病人的预后情况，但是据世界卫生组织统计，2012年全球范围内有95.2万胃癌新发病例以及72.3万死亡病例，胃癌的发生率在各类肿瘤中位列第5[1-2]。在中国，胃癌是最常见的十大肿瘤之一，国家卫计委的数据显示，胃癌的发病率紧随肺癌之后，是国内发病率第2、死亡率第3的恶性肿瘤。由于胃癌发病率高、预后差且治疗方法有限，对胃癌的诊断和治疗仍然是临床上的一个挑战[3]。胃癌的发生发展过程涉及致癌基因的激活和抑癌基因的失活，但具体作用机制仍然不是十分清楚。进一步了解胃癌发生发展过程中的分子调控机制，将对今后胃癌的临床诊疗起到十分重要的作用。

近年来大量研究表明囊泡运输在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，而胞浆内保守的Ras相关小GTP酶超家族中的Rab蛋白被证实参与了胞内囊泡运输和分泌的调控过程。基因组学分析结果显示，人类Rab家族由至少60个成员组成[4]。Rab蛋白定位于细胞亚结构中，能够调控细胞分泌、内吞、信号转导、细胞生长等生物学过程[5-9]。在乳腺癌中，Rab27a过表达时，乳腺癌细胞的侵袭与转移能力相应提高，这表明Rab27A能够通过影响细胞的侵袭和转移进而促进乳腺癌的发展[10]。在胰腺癌中，Rab27A的高表达与肿瘤晚期、脉管侵犯及预后差密切相关[11]。在对神经胶质瘤的研究中，发现Rab27A能够促进细胞的增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡，而这一作用是通过促进组织蛋白酶D的分泌实现的[12]。以上研究均表明Rab27a在肿瘤发生发展过程中起重要作用，但具体机制还有待深入探讨。

我们的前期研究结果（未发表）表明：①Rab27A在胃癌细胞系中呈现差异性表达，在低分化的 BGC823细胞中低表达，而在中分化的SGC7901细胞中高表达；②Rab27A在胃癌与癌旁组织中也呈现差异性表达，在胃癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达；③Rab27A低表达与肿瘤低分化、高TNM分期、脉管癌栓、淋巴结转移、远端转移等有明确的相关性。以上结果提示我们Rab27A很可能作为抑癌基因在胃癌发生发展过程中发挥调控作用。以此为基础，我们以Rab27A低表达的BGC823细胞系为研究模型，建立了Rab27A过表达细胞株，进行细胞增殖、侵袭、迁移等细胞功能实验，旨在进一步揭示Rab27A在胃癌发生发展过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞系培养

人胃癌细胞系BGC823（国内建系）由北京大学肿瘤医院生物化学与分子生物学实验室培养，采用含5%胎牛血清的DMEM培养液，并加入青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。细胞于37℃、5%CO2条件下常规培养，选取生长状态良好、密度适宜的细胞用于实验。

1.2 PCR

将细胞生长状态良好，密度为80%～90%的35 mm培养皿取出，弃去培养液，加入1 mL TRIzol试剂（Invitrogen公司），直接在培养皿中吹打细胞后，将溶液转移至EP管内，冰浴5 min使之充分裂解；按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，冰上静置2～3 min，4℃、12 000 r/ min离心15 min，取上层水相至新EP管内；加异丙醇0.5 mL，混匀，冰浴10 min，4℃、12 000 r/ min离心10 min，弃上清；加75%乙醇1 mL，轻微振荡洗涤沉淀，4℃、7500 r/min离心5 min，弃上清；于通风橱内晾干20 min，待呈羊齿状结晶后，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，得到细胞总RNA；分光光度计测定吸光度，-80℃保存。

总RNA逆转录为cDNA的反应体系包括总RNA 1 μg、Oligo（dT）1 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，用无RNase的水补足20 μL，轻轻混匀。反应条件为42℃30 min、85℃ 5 min，冷却至4℃，-20℃保存。

采用Thermocycler PCR仪（Biometra公司）进行RT-PCR扩增。Rab27A基因正向引物为5'-GAAG CCATAGCACTCGCAGAG-3'，反向引物为5'-ATG ACCATTTGATCGCACCA-3'，扩增片段长度为174 bp；β-actin正向引物为5'-TTAGTTGCG TTACACCCTTTC-3'，反向引物为5'-ACCTTCACC GTTCCAGTTT-3'，扩增片段长度为150 bp。20 μL扩增体系包括cDNA 2 μL，2×Tag PCR Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，用ddH2O补足。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，Rab27A和β-actin循环数分别为26和23次；最后72℃延伸10 min。反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用Alphaimag⁃er 2200分析仪（Alpha Innotech公司）检测反应条带并拍照记录。

用 Applied Biosystem 7500 Fast Real-Time PCR系统（ABi公司）及SYBR-Green Master PCR Mix试剂盒进行Real-Time PCR（qPCR）扩增。20 μL反应体系包括cDNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，50×SybGreen DyeⅠ0.4 μL，2×qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，均为40个循环。β-actin为内参。用ΔΔCt法进行数据分析，溶解曲线用于检测扩增产物的特异性。

1.3 Western印迹

取直径100 mm平皿中生长状态良好的细胞，密度为85%～95%，用PBS漂洗2次，加入200～300 μL 85℃预热的1×SDS溶液裂解细胞，并加入1%蛋白酶抑制剂（Sigma公司）；裂解样品经超声、离心，吸取上清进行UV定量，最后于-20℃分装保存；取30 μg蛋白样品与上样缓冲液混合后于100℃加热10 min，12 000 r/min离心5 min后上样，恒压电泳；350 mA恒流湿转120 min，将蛋白转移至PVDF膜上；用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，孵育一抗（anti-Rab27A，1∶100稀释，Abcam公司），4℃过夜；次日室温平衡30 min，用PBST洗膜3次，每次10 min，加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；化学发光（ECL Plus检测试剂盒，Amersham Biosciences公司），显影，定影。

1.4 细菌转化及质粒提取

从-80℃冰箱中取出50 μL Trans-T1感受态细胞，冰浴融化，加入1 μL目的质粒（由上海吉凯基因化学技术有限公司构建），轻柔摇匀，冰浴30 min，42℃水浴中热激45 s，冰浴2 min；加入500 μL无抗性LB培养基，混匀，于37℃摇床上200 r/min振荡1 h，使细菌复苏；取适量菌液涂布至LB固体培养基，倒置平皿，于37℃孵育箱中过夜，次日从每个平板上分别挑取3个点状菌落放入带有5 mL LB液体培养基的离心管中，于37℃摇床上200 r/min振荡培养14～16 h；用无内毒素高纯度质粒快速提取试剂盒（北京博迈德公司）提取质粒，紫外分光光度计定量后于-20℃保存。

1.5 稳定转染

转染前一天在35 mm平皿中接种细胞贴壁生长过夜（2×105/皿），保证转染时细胞密度为50%～70%；转染前4～6 h，换无血清无双抗（双无）的DMEM培养基饥饿处理；取250μL双无DMEM，加入2 μg目的质粒，另取250 μL双无DMEM，加入6 μL LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司），轻轻摇匀后室温静置5 min；将稀释后的质粒加入含转染试剂的DMEM中，轻柔摇匀，室温静置20 min；将上述混合物加入培养皿中，37℃、5%CO2孵育箱中培养4～6 h，换液为含5% FBS的DMEM培养基，继续培养；转染24 h后，将细胞以1∶10的比例传代至100 mm平皿中稀释培养，再过24 h加入G418（终浓度400 μg/mL，Gib⁃co-BRL公司）筛选，每隔3～4 d更换新鲜培养基一次，观察细胞形态及生长状态，直至3～4周后长出肉眼可见的抗性单克隆细胞集落。分别挑选过表达和空载单克隆扩大培养，提取细胞总蛋白和总RNA，采用PCR、Western印迹及免疫荧光鉴定过表达效率。待过表达稳定细胞系建成后，将G418浓度减至初筛浓度的一半（200 μg/mL）用以保持筛选压力，一部分细胞冻存于液氮保种，其余用于后续的生物学功能实验。

1.6 免疫荧光

将贴壁生长的对数期细胞制作细胞爬片，24 h后用1×PBS漂洗3次，每次10 min；用4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS漂洗3次，每次10 min；用0.5%TritonX-100打孔，室温孵育5 min，1×PBS漂洗3次，每次10 min；1%BSA封闭30 min后，滴加1×PBS稀释的一抗（anti-Rab27A，1∶20），湿盒内4℃孵育过夜，次日用1×PBS漂洗3次，每次10 min；滴加 TRITC标记的二抗（1∶50），37℃孵育1 h，1×PBS漂洗3次，每次10 min；DAPI（1∶50）染核，1×PBS漂洗3次，每次10 min；90%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白在细胞中的定位和相对表达量，并拍照记录。

1.7 细胞生长曲线（MTT法）

取生长状态良好的细胞，消化计数，将细胞悬液接种于96孔板（2×103/孔），设置6个平行孔；以细胞6 h贴壁后为0 h，分别按0、24、48、72、96 h依次加入MTT（终浓度为5 mg/mL），继续在37℃、5%CO2孵育箱中培养4 h，避光轻轻吸去液体；待最后一天吸完后，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），室温避光水平轻摇15 min溶解细胞中的甲瓒，用Bio-Rad酶标仪测定D570nm值，汇总实验所得数据，绘制细胞生长曲线。

1.8 软琼脂集落形成实验

配制底层胶［0.6%琼脂50 mL：2×DMEM培养基25 mL，FBS 5 mL，100×青霉素/链霉素0.5 mL，100×谷氨酰胺（200 mmol/L）0.5 mL，1.4%琼脂糖19 mL］，温度保持在42℃左右；将2 mL底层胶铺于60 mm平皿中，摇匀，室温凝固30 min；取生长状态良好的细胞，胰酶消化，计数，制成细胞悬液；配制上层胶［2.2 mL细胞悬液（含1000个细胞）与1.8 mL底层胶混匀］，铺至已凝固的底层胶上，室温静置30 min，待其凝固后转移至37℃、5%CO2孵育箱中，每隔7 d加入2 mL上层胶（细胞悬液用培养基代替），以保证胶体培养基中细胞的正常营养供给和基本湿度；观察细胞生长情况，4周后加0.2%的INT染料100 μL/皿，37℃、5%CO2孵育箱中培养过夜；次日加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）100 μL/皿，室温30 min，待琼脂糖变黄，细胞集落呈黑紫色后，观察并拍照计数，计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%

1.9 Transwell细胞迁移和侵袭实验

实验前一日，取未铺胶的 Transwell小室（Corning公司）置于24孔板内，上下室各加入500 μL无血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2孵育箱中平衡过夜；实验当日，将预铺Matrigel的Transwell小室（BD公司）置于24孔板内，室温平衡20 min，上下室各加500 μL无血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2孵育箱中水化2 h；取生长状态良好的细胞饥饿处理4 h后用胰蛋白酶消化，用无血清的DMEM培养基重悬细胞并计数；未铺胶Transwell小室中上室接种5×104细胞（300 μL），下室加入含10%FBS的DMEM培养基600 μL，于孵育箱中24 h；预铺胶小室中上室接种5× 104细胞（500 μL），下室加入含 10% FBS的DMEM培养基600 μL，于培养箱中48 h；培养结束取出24孔板，弃小室内液体，PBS漂洗1次，用棉签擦洗上室中的细胞，用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS漂洗，0.1%结晶紫室温染色20 min，PBS漂洗，室温干燥，显微镜下观察并拍照。

1.10 统计学分析

统计分析采用SPSS 13.0统计软件（IBM公司）进行。数据以x±s表示，应用双侧t检验分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BGC823细胞中Rab27A过表达效率鉴定

以Rab27A低表达的胃癌细胞系BGC823为细胞模型，通过脂质体转染，并经4周的G418筛选，获得候选的Rab27A过表达稳定细胞株。PTPCR、Real-time PCR结果显示，过表达单克隆细胞中Rab27A mRNA表达水平显著高于空载对照（图1，A～C）。Western印迹及免疫荧光结果也表明，与空载对照相比，过表达单克隆细胞中的Rab27A蛋白表达水平明显升高（图1，D、F）。以上结果表明该过表达单克隆可以用于下游的细胞功能实验。

2.2 过表达Rab27A对BGC823细胞增殖能力没有显著影响

为了检测过表达 Rab27A对胃癌细胞系BGC823增殖能力的影响，我们进行了MTT及软琼脂集落形成实验。MTT实验结果显示，与空载对照相比，过表达单克隆细胞的生长曲线并无显著变化（图2A）。软琼脂集落形成实验结果也显示，与空载对照相比，过表达单克隆细胞的克隆形成数量及大小并无显著差异（图2，B～D）。以上结果表明过表达Rab27A并不影响BGC823细胞的增殖能力。

2.3 过表达Rab27A可以抑制BGC823细胞的迁移和侵袭

采用Transwell小室检测过表达Rab27A对细胞体外迁移和侵袭的能力的影响。通过镜下观察穿过基膜或基质胶的细胞密度，我们发现过表达Rab27A后穿过基膜或基质胶的细胞数量明显减少，随机选取至少3个视野进行细胞计数，经统计学分析，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。以上结果说明过表达Rab27A可以抑制BGC823细胞的迁移和侵袭。

3 讨论

图1 BGC823细胞中Rab27A过表达效率鉴定

图2 过表达Rab27A对BGC823细胞增殖能力的影响

图3 过表达Rab27A对BGC823细胞迁移和侵袭能力的影响

本研究表明，过表达Rab27A对胃癌细胞系BGC823的增殖能力没有明显影响，但对体外迁移和侵袭能力有显著抑制作用。我们的前期研究也显示Rab27A在胃癌组织中低表达，并且其低表达与肿瘤低分化、淋巴结转移及预后不良明确相关（未发表）。提示Rab27A很可能通过抑制胃癌细胞的侵袭和转移进而阻止疾病进展，此外，我们在结直肠癌中也发现Rab27A作为抑癌基因发挥作用[13]。但这一观点与文献报道并不一致。在乳腺癌中，Rab27A的增殖性表达会促进人雌激素受体（ER）阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231与MDA-MB-435的侵袭和转移[10，14]。在小鼠宫颈癌细胞中，由Rab27A依赖性途径产生的外泌体与细胞因子或金属蛋白酶共作用，会诱导聚集一定量的中性粒细胞，这些中性粒细胞会促进4T1肿瘤的局部生长；当Rab27A表达受到阻滞时，4T1肿瘤生长及肺转移的发生率会相应降低[15]。此外，临床研究发现，Rab27A在原发性肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁配对组织，且相比于Rab27A阴性表达患者，Rab27A阳性表达患者的生存期明显缩短[16]。以上研究均说明Rab27A能促进肿瘤进展。因此，Rab27A在肿瘤进展中的作用具有肿瘤特异性，在不同类型的肿瘤中很可能发挥不同的作用。这种同一分子在不同类型肿瘤中作用截然相反的现象，很可能归因于Rab27A的生物学作用受时间和空间的严格调控，因而在不同组织，乃至同一疾病的不同阶段发挥完全不同的作用。具体来说，Rab27A很可能通过与不同的效应分子相结合进而发挥不同的调控作用[17]。

Rab27A与外泌体的胞外分泌过程密切相关。在人宫颈癌细胞中，Rab27A与Rab27B能够调控外泌体的胞外分泌过程[15]，其中Rab27A是调节分泌前阶段的重要分子，它决定了分泌前阶段颗粒池的大小[18]。研究表明，在裸鼠乳腺转移癌移植瘤模型中，Rab27A与几个其他的肿瘤转移相关基因参与了囊泡运输过程[19]。值得注意的是，肿瘤细胞分泌的外泌体在肿瘤发生发展过程中起重要作用：一方面，含有肿瘤相关抗原的外泌体将抗原转移给树突细胞，树突细胞将这些抗原呈递给T淋巴细胞，发挥免疫促进作用，抑制肿瘤进展[20-21]；另一方面，外泌体可通过FAS/FASL通路使大量具有杀伤活性的T淋巴细胞凋亡[22-24]，通过可溶性NKG2D受体配体使NK细胞杀伤活性大幅下降[25-26]，并且还可以诱导骨髓来源抑制性细胞活化，最终使机体免疫系统瘫痪，促进肿瘤的进展[23]。因此，我们推测，Rab27A很可能通过调控外泌体的分泌过程影响胃癌进展。

综上，胃癌中的Rab27A很可能作为抑癌基因发挥作用，能够延缓肿瘤进展，有助于病人预后。但是，Rab27A调控胃癌进展的分子机制尚未明确，有待深入探讨。

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Im pact of Rab27A Overexpression on Biological Behavior of Gastric Cancer Cell Line BGC823

WANG Qian,YANG Jing-Wen,WANG Fei-Fei, WANG Ru-Liang,LI Guang-Hui,XIAO Wen-Hua*
Department of Oncology,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100037,China

Objective:To explore the relationship between Rab27A and the malignant biological behavior of gas⁃tric cancer cells.Methods:Rab27A was overexpressed in gastric cancer cell line BGC823.MTT,soft agar colony formation and transwell assay were used to observe the malignant behavior change.Results:The migrative and in⁃vasive ability of BGC823 cells were obviously reduced after Rab27A overexpression,while the proliferation of BGC823 cell line was not apparently changed.Conclusion:Rab27A might be an anti-oncogene during the devel⁃opment of gastric cancer,which provide new evidence and potential therapeutic target for the clinical treatment of gastric cancer.

Rab27A;gastric cancer;proliferation;migration;invasion

R735.2

A

1009-0002（2017）02-0077-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.002

2016-10-17

国家自然科学基金（81372220）

王倩（1990-），女，硕士研究生；杨静文（1983-），女，博士，助理研究员；二者同为第一作者

肖文华，（E-mail）w_hxiao@hotmail.com

*Corresponding author,E-mail:w_hxiao@hotmail.com