血红素加氧酶-1对大鼠体外循环术后肺组织抗炎性损伤的研究

生伟 潘丽华 池一凡 孙龙 牛兆倬 林明山

基础研究

血红素加氧酶-1对大鼠体外循环术后肺组织抗炎性损伤的研究

生伟 潘丽华 池一凡 孙龙 牛兆倬 林明山

目的 观察钴原卟啉诱导肺组织血红素加氧酶-1（HO-1）表达在大鼠体外循环术后肺组织损伤中发挥的抗炎性损伤作用，并对其作用机制进行分析。方法 雄性Wistar大鼠144只，随机分为3组：A组（对照组）、B组（钴原卟啉，CoPP）、C组［钴原卟啉（CoPP）+锌原卟啉（ZnPP）］。建立改良大鼠体外循环肺损伤模型。制模前24 h，A组大鼠腹腔注射生理盐水，B组腹腔注射CoPP（5 mg/kg），C组腹腔注射CoPP（5 mg/kg）和ZnPP（5 mg/kg）。制模成功后采用断颈法分别于体外循环前（T0），体外循环结束即刻（T1），体外循环后2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）将大鼠处死，每个时间点8只。取肺组织检测相应的指标。用多聚甲醛固定部分右肺组织，然后用石蜡包埋,以用于HO-1蛋白表达的免疫组化方法测定。剩余肺组织置于液氮中冻存备用，用于检测肺组织匀浆胆红素的含量，酶联免疫吸附（ELISA）法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达。结果 B组大鼠肺组织中HO-1蛋白表达在体外循环（CPB）开始前后均有明显增加，其活性测定结果与蛋白表达结果一致，在各时间点均强于A组和C组（P＜0.05）；各组HO-1蛋白表达在T2期最高，A、B、C三组分别为0.1852±0.070、0.2873±0.091、0.1917±0.082。B组大鼠肺组织TNF-α含量在CPB后各时间点均低于A组和C组（P＜0.05）；三组TNF-α的含量在T2期最高，分别为（480.42±41.67）pg/ml、（358.19±32.35）pg/ml、（466.53±39.42）pg/ml。结论 CoPP可以诱导肺组织HO-1的高表达，而且经过CPB后仍保持较高的表达。内源性HO-1高表达在体外循环肺损伤中具有抗炎作用，可有效抑制TNF-α炎性细胞因子分泌，从而减轻体外循环术后肺的炎性损伤。

血红素加氧酶-1； 体外循环； 肺损伤； 炎症反应

血红素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）作为一种内源性的保护基因[1]，在肺脏疾病的发生发展过程中起到重要的作用。本实验旨在研究HO-1在体外循环术后对肺组织炎性损伤发挥的保护作用，并探讨其发挥保护作用可能的机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组 本实验以雄性Wistar大鼠为研究对象，共144只，体重250～350 g，由青岛市药品检验所动物实验中心提供。按照随机原则将大鼠分为3组，每组48只。A组（对照组，n=48）：模型建立前24 h腹腔注射生理盐水；B组［钴原卟啉（CoPP）组，n=48］：模型建立前24 h腹腔注射CoPP（5 mg/kg）；C组［钴原卟啉（CoPP）+锌原卟啉（ZnPP）组，n=48］：模型建立前24 h腹腔注射CoPP（5 mg/kg）和ZnPP（5 mg/kg）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 改良大鼠体外循环肺损伤模型的建立：采用复合诱导麻醉，通过右侧颈内动脉和颈静脉通路建立体外循环（CPB）。贮血器置于大鼠心脏平面以下40 cm左右，静脉血经过变温器变温,膜肺氧合后通过蠕动泵灌注进入右侧颈内动脉。CPB开始前经股静脉置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血时间（ACT）在480 s以上才能开始转流。胸骨正中切口，切开心包，分离主肺动脉，平均动脉压在CPB过程中维持在55～60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。转流渐趋平稳，CPB开始后10 min阻断肺动脉，停止机械通气，并在循环50 min后开放肺动脉，将颈静脉插管退回至右心房内，恢复机械通气，逐渐复温，30 min内肛温达到36.0℃左右停止体外循环。改良大鼠体外循环肺损伤模型模拟图见图1。

1.2.2 标本采集 建立改良大鼠CPB肺损伤模型后，采用断颈法分别于体外循环前（T0），体外循环结束即刻（T1），体外循环后2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期将实验动物杀死，每个时间点8只。取肺组织作相应指标检测。打开胸腔，取右肺组织，用4%的多聚甲醛固定部分肺组织，然后石蜡包埋,以备HE染色及各指标的免疫组织化学法测定。余肺组织置于液氮中冻存备用。

1.2.3 观察指标 ①肺组织HO-1蛋白表达的位置及强度：采用免疫组化链霉素亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）法检测，阳性表达为棕黄色颗粒。应用Image-Pro Plus 6.0病理图文分析系统分析图像，随机选择5个不同视野，测定阳性产物表达的平均光密度值（OD值），HO-1蛋白阳性表达的强度用5个不同视野OD值的均值来表示。②肺组织HO-1活力测定：根据HO-1降解血红素生成一氧化碳和胆红素的原理，计算肺组织中生成胆红素的量评估肺组织HO-1的活性。选择464 nm和530 nm双波长分光光度法测定肺组织匀浆中胆红素生成量。胆红素摩尔吸光系数为40 mol·L-1·cm-1，其结果用pmol·mg-1·h-1表示。③肺组织TNF-α的含量测定：称取所需检测肺组织50 mg置入预冷的生理盐水中，制成10%肺组织匀浆液，分离上清液，并用液氮尽快将其冷冻，将冷冻好的上清液标本置于-80℃的低温冰箱冻存备用。各组大鼠肺组织TNF-α的含量表达测定选用酶联免疫吸附法（ELISA），按照检测试剂盒具体操作说明进行。

1.3 统计学方法 应用统计软件SPSS 16.0进行数据分析。经方差分析进行正态性检验，计量资料为正态分布，全部数据采用±s表示，各组组间、组内数据的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织中HO-1蛋白表达 主要表达在细胞的细胞膜或细胞浆中，阳性细胞表现为棕黄色染色。采用免疫组化方法显示肺组织细胞中HO-1蛋白阳性表达主要分布在细支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞，在肺组织血管内皮也有少量表达。统计数据显示，B组肺组织HO-1蛋白表达在CPB前后各期均显著强于A组和C组（P＜0.05）。各组大鼠肺组织在经过CPB后HO-1蛋白表达增加，在T2点表达最多。平均光密度值结果分析支持以上描述。免疫组化检测的HO-1表达见表1及图2。

2.2 肺组织HO-1活力测定 各组大鼠肺组织HO-1活力经过CPB后逐渐增加，在T2点活力最强，其后逐渐降低。B组肺组织HO-1活力在CPB前后各期均高于A组和C组（P＜0.05）。肺组织HO-1活力测定结果与免疫组化法检测的HO-1蛋白表达情况相一致。见表2。

2.3 肺组织TNF-α的含量测定 各组大鼠肺组织TNF-α的含量在 CPB前未见统计学差异（P＞0.05）；CPB后TNF-α的含量逐渐增加，到T2点增加最明显，之后逐渐下降。在CPB后各期，B组TNF-α的含量均低于A组和C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

机体的某些组织器官以及一些细胞在一定应激条件下，会诱导生成HO-1，发挥抗炎性反应、抗氧化应激[1,2]及抗增生、抗细胞调亡的效应[3,4]。肺损伤（lung injury，LI）是心脏外科领域尤其是体外循环术后发生最早、最普遍，也是最难治疗的并发症之一[5,6]。目前有许多研究证实HO-1在肺脏疾病中发挥保护作用。大多心脏外科手术需要经过体外循环甚至深低温停循环这样一个非生理过程，对于经过这样一个复杂的病理生理过程后，HO-1是否仍能发挥肺损伤保护作用，如果其仍能起到保护作用，其具体的机制又如何？目前国内外研究较少。本实验重点研究在体外循环术后肺组织炎性损伤的检测，探讨HO-1在体外循环术后对肺损伤发挥的抗炎性损伤作用，并具体研究其发挥保护作用可能的机制。

本实验表明，在CPB前各组大鼠肺组织HO-1表达较少，表明正常情况下HO-1表达较少。CPB后大鼠肺组织HO-1表达逐渐增加，表明CPB带来缺血再灌注损伤的同时，也启动了HO-1表达的内在保护系统。本研究表明，在CPB前及CPB后各时间点CoPP组HO-1表达明显高于对照组，表明钴原卟啉可以诱导肺组织HO-1蛋白的表达；而加入锌原卟啉后HO-1表达与对照组无明显差异，说明锌原卟啉抑制了肺组织HO-1蛋白的表达。

目前已经有大量的数据资料证实，体外循环过程中不可避免地引起诸多细胞因子的激活[7,8]。在体外循环这一非生理性的灌注过程以及其结束后的再灌注损伤过程中细胞因子在机体内发生的变化非常大，而这些炎性物质的变化又反过来对体外循环过程中各组织器官产生较为复杂的影响。体外循环过程中肺的缺血再灌注损伤是由大量细胞因子和许多炎症介质一起介入的一个非免疫性的炎症损伤过程。这些炎症介质会导致血管内皮的损伤，在再灌注发生时会引起组织器官的损伤，发生一系列的病理改变。在释放的众多细胞因子中，TNF-α可能是最早释放的一种，它也是一系列细胞因子的启动因子[9]。本实验表明，体外循环开始后各组大鼠肺组织炎性因子TNF-α均持续性升高，提示炎性反应的发生。已有的实验表明，IL-6、TNF-α能够导致肺脏早期炎症反应的发生，还会引起一些毒性产物的释放，并会引起肺毛细血管通透性的增加、结构和功能的改变，使肺内炎性渗出增加和肺水肿发生，对肺脏产生直接的损伤[10,11]。TNF-α能够激活一系列促炎因子的产生，导致中性粒细胞的呼吸爆发，进而引发广泛的炎症级联反应。与此同时，氧自由基大量产生，能够使中性粒细胞与内皮细胞黏附增加，从而导致肺损伤的发生。本研究中，三组大鼠TNF-α在体外循环后各时间点均有不同程度地升高，且在CPB术后2 h达高峰。钴原卟啉（CoPP）组大鼠肺组织的TNF-α在体外循环后各时间点低于对照组，表明体外循环过程中确实发生了炎症反应。而内源性HO-1高表达具有明显的抗炎症反应的作用，它能够使炎性细胞因子TNF-α的分泌明显减少，因此进一步抑制其他炎性细胞的激活、炎症刺激的迁移以及炎症反应过程中细胞黏附的发生发展，从而抑制肺组织炎性损伤的发生发展。而加入了锌原卟啉（ZnPP）的大鼠肺组织的TNF-α与对照组无明显差异，表明HO-1的这种抗炎作用可被HO-1特异性抑制剂所抑制。

表1 各组大鼠不同时间点肺组织HO-1的表达比较（±s）

表1 各组大鼠不同时间点肺组织HO-1的表达比较（±s）

注：A组：对照组；B组：钴原卟啉（CoPP）组；C组：钴原卟啉（CoPP）+锌原卟啉（ZnPP）组。与本组TO时比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05；与B组比较，cP＜0.05

组别 例数 T0 T1 T2 T3 T4 T5 A组 8 0.1142±0.058 0.1425±0.064a 0.1852±0.070a 0.1683±0.076a 0.1518±0.065a 0.1439±0.066aB组 8 0.1820±0.067b 0.2386±0.085ab 0.2873±0.091ab 0.2578±0.084ab 0.2375±0.087ab 0.1849±0.072abC组 8 0.1138±0.061c 0.1486±0.064ac 0.1917±0.082ac 0.1712±0.075ac 0.1572±0.069ac 0.1430±0.059ac

表2 各组大鼠不同时间点肺组织HO-1的活力测定比较（±s）

表2 各组大鼠不同时间点肺组织HO-1的活力测定比较（±s）

注：A组：对照组；B组：钴原卟啉（CoPP）组；C组：钴原卟啉（CoPP）+锌原卟啉（ZnPP）组。与与本组TO时比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05；与B组比较，cP＜0.05

组别 例数 T0 T1 T2 T3 T4 T5 A组 8 115±12 125±13a 159±14a 140±14a 135±16a 121±9aB组 8 153±15b 346±29ab 692±52ab 480±45ab 420±33ab 317±30abC组 8 121±17c 138±18ac 161±20ac 145±16ac 140±15ac 129±12ac

表3 各组大鼠肺组织TNF-α的含量测定比较（pg/ml，±s）

表3 各组大鼠肺组织TNF-α的含量测定比较（pg/ml，±s）

注：A组：对照组；B组：钴原卟啉（CoPP）组；C组：钴原卟啉（CoPP）+锌原卟啉（ZnPP）组。与与与本组TO时比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05；与B组比较，cP＜0.05

组别 例数 T0 T1 T2 T3 T4 T5 A组 8 120.52±11.68 345.41±31.26a 480.42±41.67a 391.75±36.35a 323.82±28.49a 230.36±25.72aB组 8 118.46±11.25 251.37±24.28ab 358.19±32.35ab 302.37±27.72ab 220.25±25.16ab 170.57±20.15abC组 8 119.32±11.39 343.45±30.28ac 466.53±39.42ac 378.83±35.12ac 317.28±27.23ac 219.67±22.46ac

综上所述，钴原卟啉可以诱导肺组织HO-1的高表达，使其活性增加，而且经过体外循环这一复杂的病理生理过程后，仍保持较高的表达。内源性HO-1高表达在体外循环肺损伤中具有抗炎作用，可有效抑制TNF-α炎性细胞因子分泌，从而减轻体外循环术后肺的炎性损伤。因此，通过各种途径诱导HO-1在肺组织的高表达，能够为心脏外科领域体外循环过程中肺功能的保护提供一种新的方法。

（本文图片见后插二）

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Research on the anti-inflammation effect and mechanism of heme oxygenase-1 on lung injury after cardiopulmonary bypass

SHENG Wei＊，PAN Li-hua，CHI Yi-fan，et al.＊Department of Cardiovascular Surgery，Qingdao Municipal Hospital，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China Corresponding author：SUN Long，E-mail：sw8011@126.com

ObjectiveThe aim of this study is to determine the anti-inflammation effects of heme oxygenase-1 on lung injury after cardiopulmonary bypass,and to investigate its probable mechanisms.Methods144 male Wistar rats were divided into 3 groups:group A（control group），group B（cobalt protoporphyrin，CoPP），group C［CoPP and zinc protoporphyrin（ZnPP）］randomly.A modified rat model of CPB-induced lung injury was established.Normal saline was injected 24 h before modified rat model establishment in group A intraperitoneally，and CoPP（5 mg/kg）in Group B，CoPP（5 mg/kg）and ZnPP（5 mg/kg）in group C respectively.After the modified rat model was established，the lung tissues were taken at different time for the relevant indicators test:before CPB（T0），0 min after CPB（T1），2 h after CPB（T2），6 h（T3），12 h（T4）and 24 h（T5）.Partial right lung tissue of rats in each group was fixed by paraformaldehyde as soon as excision，and then it was embedded in paraffin，then used for the test the expression of HO-1 protein in each group by immunohistochemistry.The rest of thelung tissue was placed in liquid nitrogen for detection of lung tissue homogenate bilirubin content，and the determination of TNF-α expression by ELISA method.ResultsThe HO-1 protein expressions in lung tissue in group B were higher than those in group A and group C in any given time interval，and the same as HO-1 activity（P＜0.05），the expressions of HO-1 protein of group A，B and C at T2 stage were 0.1852±0.070，0.2873±0.091，0.1917±0.082 respectively.TNF-α content in group B at all time point after bypass were lower than those of group A and group C（P＜0.05），the TNF-α contents of group A，B and C at T2 stage were（480.42±41.67）pg/ml，（358.19±32.35）pg/ml，（466.53±39.42）pg/ml respectively.ConclusionCoPP can induce a large amount of HO-1 expression in lung tissue，and it is still highly expressed after CPB，so as to play an important part in anti-inflammation，and reduce lung injury.

Heme oxygenase-1； Cardiopulmonary bypass； Lung injury； Inflammation reaction

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.08.025

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2017）08-0764-04

2017-01-16）

青岛市卫计委课题（项目编号：2013-WSZD012）

266071 山东省青岛市，青岛大学附属青岛市市立医院心脏中心（生伟、池一凡、孙龙、牛兆倬、林明山）；威海市立医院心内科（潘丽华）

孙龙，E-mail：sw8011@126.com