活细胞内基于Diels-Alder反应的量子点标记蛋白质研究

王明秀,张加玲,刘云凤,乔增杰

(山西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室,太原 030001)

活细胞内基于Diels-Alder反应的量子点标记蛋白质研究

王明秀,张加玲,刘云凤,乔增杰

(山西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室,太原 030001)

目的 建立一种基于Diels-Alder环加成反应用于活细胞内量子点(quantum dots,QDs)标记蛋白质的新方法。 方法 反式环辛烯(trans-cyclooctene 2,TCO2)修饰的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors,TALE)蛋白与偶联四嗪(tetrazine 1,Tz1)的红色量子点QD625在Vero活细胞内特异性结合,形成量子点荧光标记的蛋白TALE-QD625,通过激光共聚焦显微镜观察TALE-QD625在Vero细胞内的荧光信号分布。 结果 基于Tz1和TCO2的Diels-Alder环加成反应在Vero活细胞内将QD625标记至TALE蛋白,并随TALE进入细胞核内,在核内观察到红色的QDs荧光信号,成功建立活细胞内量子点标记蛋白方法。 结论 通过Diels-Alder环加成反应首次实现活细胞内量子点标记蛋白,为蛋白单分子成像提供一种新的标记方法。

蛋白质标记; 量子点; Diels-Alder环加成反应; 活细胞; 荧光纳米材料

活细胞内单分子成像技术的发展丰富了对单个蛋白分子在其自身环境中的行为及功能的认识[1,2]。量子点(quantum dots,QDs)作为一种新型的荧光纳米材料,具有独特的光物理性质,如激发波谱宽、发射波谱窄、发光效率高、颜色可调、光稳定性好等,在单分子成像中具有突出优势[3]。

准确有效地将QDs偶联至待标记蛋白分子是活细胞内单分子蛋白实时可视化研究的基础[3]。目前主要使用链霉亲和素涂层的QDs标记生物素化蛋白,该方法是基于链霉亲和素与生物素的亲和反应实现的,具有较高的亲和力与较强的特异性,且只需在蛋白中引入15个氨基酸的小肽,不干扰蛋白的结构和功能[4,5]。但是,由于链霉亲和素表面有4个生物素结合位点、细胞内本身含有生物素以及小肽介导的QDs修饰蛋白方法较少等,限制了QDs在活细胞内蛋白单分子成像中的研究与应用[6]。

基于四嗪(tetrazine 1,Tz1)与反式环辛烯(trans-cyclooctene 2,TCO2)的Diels-Alder环加成反应可用于活细胞内荧光素标记蛋白,在待标记蛋白中引入13个氨基酸的小肽-硫辛酸连接酶受体肽(LplA acceptor peptide,LAP),不影响其生物活性[7]。同链霉亲和素与生物素的亲和反应相比,Tz1与TCO2的反应具有更为特异、高效、快速、简便等特点[8]。本研究旨在建立基于Tz1与TCO2的Diels-Alder环加成反应用于活细胞内量子点标记蛋白技术,为活细胞内蛋白单分子成像的量子点标记技术提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞系与质粒

非洲绿猴肾细胞(Vero)、pcDNA3.1-TALE、pEGFP-Histone由山西医科大学卫生检验教研室保存,pcDNA3.1-TALE表达类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors,TALE)蛋白,该蛋白可以进入细胞核内,pEGFP-Histone表达绿色荧光蛋白EGFP标记的组蛋白(histone);pcDNA3-LplA(W37V)购自Addgene,表达硫辛酸连接酶(lipoic acid ligase,LplA);pcDNA3.1(+)购自Invitrogen,为哺乳动物表达载体。

1.2 主要试剂与仪器

Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)、DMEM高糖培养基(Hyclone,USA)、胎牛血清FBS(Hyclone,USA)、QD625-COOH(Invitrogen,USA)、100 kDa离心式超滤管(Milipore,Germany)、玻璃底皿(Corning,USA)、KOD FX DNA聚合酶(Toyobo,Japan)、DNA Marker(TransGen Biotech,China)、限制性内切酶(Thermo Fermentas,USA)、T4 DNA连接酶(Takara,Japan)。EDC、四嗪、顺式-环辛-4-烯醇、苯甲酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、DMF、三乙胺、5-氨基戊酸均购自美国Sigma公司。引物合成、DNA测序由武汉擎科生物技术有限公司完成。

激光共聚焦显微镜(UltraView VOX),美国PerkinElmer公司。核磁共振仪(AV400),德国Bruker公司。核酸电泳仪(SUB-cell GT)、凝胶成像系统(SUB-cell GT)、PCR仪(Veritee96-well),美国Bio-Rad公司。

1.3 量子点标记蛋白方法

[9]，设计基于Tz1与TCO2的环加成反应用于活细胞内量子点标记蛋白的方法以及TCO2和Tz1的结构式(见图1)。将LAP克隆至TALE末端,构建融合蛋白TALE-LAP;在LpIA的作用下,TCO2连接至蛋白TALE(TALE-LAP-TCO2);Tz1偶联至羧基修饰的红色量子点QD625-COOH形成QD625-Tz1;通过TCO2和Tz1的环加成反应将TALE-LAP-TCO2与QD625-Tz1连接,即实现TALE被QD625标记(TALE-LAP-TCO2-Tz1-QD625)。

1.4 pcDNA3.1-TALE-LAP表达载体的构建

LAP的氨基酸序列为GFEIDKVWYDLDA。将LAP的核苷酸序列设计至反向引物中合成,通过PCR连接到TALE蛋白末端,经酶切位点Hind Ⅲ和BamH Ⅰ克隆至pcDNA3.1(+),双酶切并测序验证。正向引物:5′-GCTAAGCTTGCCACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAG-3′,反向引物:5′-GTAGGATCCTTAGGCGTCCAGGTCGTACCACACCT-TGTCGATCTCGAAGCCGGCAACGCGATGGGATGTGCGTTCGGGAAT-3′,下划线分别表示Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的酶切位点,黑体为kozak序列,斜体为LAP的核苷酸序列。

1.5 TCO2合成

参照文献[7]的方法合成,将0.25 g顺式-环辛-4-烯醇与0.275 g苯甲酸甲酯溶于25 ml乙醚和正己烷(9 ∶1)的混合液中,紫外(254 nm)照射4 h,产物经硅胶银柱(AgNO3∶SiO2=1 ∶9)洗脱(乙酸乙酯 ∶石油醚=1 ∶10),生成中间产物反式-环辛-4-烯醇。取50 mg反式-环辛-4-烯醇,溶于10 ml二氯甲烷,再加入0.2 g吡啶和100 mg对硝基苯基氯甲酸酯,混匀、搅拌过夜;产物减压浓缩除去挥发性物质,加入10 ml DMF和0.4 ml的三乙胺混合液以及120 mg 5-氨基戊酸,室温搅拌20 h;产物用40 ml水稀释,分别用20 ml乙酸乙酯抽提2次、10%醋酸调节pH至4-5、50 ml二氯甲烷萃取3次,最后用Na2SO4干燥、过滤、蒸发至粉末状产物;产物经硅胶银柱洗脱并送核磁鉴定。

取5 mg反应产物溶解至CDCl3,经1H核磁共振(NMR)鉴定TCO2是否成功合成。

1.6 Tz1偶联QD625-COOH(QD625-Tz1)

将8 μmol/L QD625-COOH加入到配有搅拌器的小型反应容器中,搅拌至混匀,加入5 mg/ml Tz1,搅拌5 min,降低搅拌速度,加入10 mg/ml EDC催化,室温反应4 h;离心去除团聚物(12 000 r/min,3 min),再经0.22 μm针头式滤器过滤;用100 kDa离心式超滤管将样品浓缩纯化5次,浓缩比为10;终产物溶于1 ml PBS溶液,合成终浓度为1 μmol/L的QD625-Tz1。分别取2 μl QD625-COOH与QD625-Tz1经1%的琼脂糖凝胶电泳验证偶联是否成功[10]。

1.7 活细胞内QDs标记蛋白质

QD625-Tz1标记TCO2修饰的蛋白TALE在Vero活细胞内进行,Vero细胞采用含10%灭活FBS的DMEM培养液,在37 ℃及5 % CO2饱和湿度的条件下培养。取生长良好的细胞,以5×104个细胞浓度接种到25 cm2玻璃底培养皿,分为实验组和对照组。实验组培养至细胞密度为80%左右,以Lipofectamine 2000为载体将1μg pcDNA3.1-TALE-LAP、1 μg pcDNA3.1-LpIA和1 μg pEGFP-Histone共转染至Vero细胞,培养4-6 h,加入1 μmol/L QD625-Tz1和200 μmol/L TCO2各2 μl,继续培养20 h。对照组只需转染1 μg pEGFP-Histone,其他操作同实验组。培养结束后,将培养皿置于激光共聚焦显微镜下观察QDs荧光信号在Vero细胞内的分布情况,并对实验组Vero细胞Z轴层扫成像,进一步观察QDs荧光信号在不同扫描层面成像的变化。

2 结果

2.1 融合肽TALE-LAP双酶切、测序鉴定

重组质粒pcDNA3.1-TALE-LAP经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切成5 230 bp和2 430 bp两条特异性条带(见图2),与TALE-LAP的大小相符。测序结果与TALE-LAP的阅读框序列一致。

图2 pcDNA3.1-TALE-LAP双酶切验证分析Figure 2 Identification of pcDNA3.1-TALE-LAP by double restriction analysis

2.2 TCO2与QD625-Tz1的合成鉴定

经鉴定,TCO2的1HNMR(400 MHz,CDCl3)波谱见图3A,成功合成TCO2。

QD625-Tz1及QD625-COOH琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3B,QD625-COOH带负电荷,由阴极侧向阳极侧移动,而经Tz1修饰后形成的QD625-Tz1表面负电荷大部分被中和,所以QD625-Tz1在琼脂糖凝胶电泳中的移动受阻,大部分滞留在胶孔处。这一结果说明Tz1成功偶联QD625。

图3 TCO2的1H核磁共振波谱与QD625-Tz1的琼脂糖凝胶电泳结果Figure 3 1H nuclear magnetic resonance spectrum of TCO2 and agarose gel electrophoresis of QD625-Tz1

2.3 活细胞内QD625标记TALE

Vero活细胞内QD625标记TALE的激光共聚焦显微成像结果见图4。实验组细胞核内可见红色的QDs荧光信号(图4A);对照组细胞核内未见红色的QDs信号(图4B)。

白色曲线包围部分为Vero细胞的细胞核,被Histone-GFP标记为绿色,白色箭头指示QDs的荧光信号图4 Vero活细胞内QD625标记蛋白TALE共聚焦成像(scale bar=2 μm)Figure 4 Confocal imaging of TALE labeled with QD625 in live Vero cells(scale bar=2 μm)

为进一步证实实验组红色的QDs荧光信号在Vero细胞核内,激光共聚焦显微镜对Vero细胞Z轴层扫成像,从41张扫描图片中选取9张(见图5)。白色箭头指示为QD625-Tz1的荧光信号在细胞核内的分布情况,Z轴方向QDs荧光信号从无到有,最后又消失,证实了QDs信号在Vero细胞核内,表明TALE成功将QD625带入Vero细胞核内,说明Vero活细胞内QD625成功标记蛋白TALE。

扫描厚度:0.2μm;标尺:2 μm图5 TALE-QD625荧光信号在Vero细胞Z轴层扫成像过程中的变化Figure 5 Changes of TALE-QD625 signal in Vero cells along the Z-axis

3 讨论

活细胞内单个蛋白分子实时可视化研究对于理解生命的分子基础有着重要的意义,而发展活细胞内蛋白分子的标记方法将有助于可视化研究的实现。QDs作为一种新型的荧光纳米材料,因其独特的光物理特性,目前已成为活细胞单个蛋白分子成像的强有力工具[11]。

本研究利用Tz1与TCO2的Diels-Alder环加成反应在Vero活细胞内实现蛋白TALE被QDs标记,首次建立了一种新的活细胞内QDs标记蛋白技术,将有望用于活细胞内以及细胞核内相关蛋白的分子影像学研究,促进对细胞质内或细胞核内特定蛋白的行为及功能的深入认识,如通过QDs标记细胞核内转录因子蛋白,有可能实时观察到该蛋白在转录过程中所发挥的作用。此外,由于不同粒径大小的QDs具有不同的发射光谱,在激光共聚焦显微镜照射下显示出不同的颜色,结合其他标记方法,可在活细胞水平实现对不同蛋白的多色成像,动态研究不同蛋白之间的相互作用关系。

与传统的链霉亲和素生物素亲和反应相比,Tz1与TCO2之间的反应具有更多优点,如结合特异性更强、标记效率更高、反应速度更快、原料简单易得等。本研究不仅丰富了活细胞内QDs标记蛋白的方法,而且为活细胞内单个蛋白分子实时可视化研究提供强有力的技术支撑。

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ProteinlabelingwithquantumdotsinlivecellsbasedonDiels-Alderreactions

WANG Mingxiu,ZHANG Jialing,LIU Yunfeng,QIAO Zengjie

(DepartmentofSanitaryInspection,SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

ObjectiveTo establish a new method of labeling a protein with quantum dots(QDs) within live cells via the Diels-Alder cycloaddition.MethodsTranscription activator-like effectors(TALE) decorated with trans-cyclooctene TCO2 and tetrazine 1(Tz1)-conjugated QD625 were combined specially in the live Vero cells to yield a QD625-labelled TALE(TALE-QD625). The distribution of fluorescent signal for TALE-QD625 in Vero cells were observed through confocal microscopy.ResultsThe QD625 was conjugated with TALE based on the Tz1 and TCO2 Diels-Alder cycloaddition labeling system and subsequently entered the cell nucleus. Red fluorescent signal of TALE-QD625 was observed in the nucleus of Vero cells.ConclusionIt is the first time that QDs have been used to specially label a protein via the Diels-Alder cycloaddition within live cells, which will provide a new labeling method for single protein molecule imaging.

protein labeling; QDs; Diels-Alder cycloaddition; live cell; fluorescent nanomaterial

R113

A

1007-6611(2017)09-0895-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.006

病毒学国家重点实验室开放研究基金资助项目(2017IOV005);山西医科大学青年基金资助项目(02201512)

王明秀,女,1989-08生,硕士,助教,E-mail:wangmingxiu0818@163.com

2017-05-19