甲基强的松龙联合过表达BDNF的ADSCs在治疗大鼠急性脊髓损伤中的作用

姬文晨,蒋婉婷,张党锋,冯 娇,韩亚红,李 萌*

(1西安交通大学第一附属医院骨科,西安 710061;2西安市第四医院超声诊断科;*通讯作者,E-mail:drleemon@163.com)

甲基强的松龙联合过表达BDNF的ADSCs在治疗大鼠急性脊髓损伤中的作用

姬文晨1,蒋婉婷2,张党锋1,冯 娇1,韩亚红1,李 萌1*

(1西安交通大学第一附属医院骨科,西安 710061;2西安市第四医院超声诊断科;*通讯作者,E-mail:drleemon@163.com)

目的 观察甲基强的松龙(MP)联合过表达脑源性神经生长因子(BDNF)的脂肪干细胞(ADSCs)在治疗大鼠急性脊髓损伤(SCI)中的作用。 方法 48只SD大鼠脊髓损伤模型分为4组:对照组(切断脊髓,未给予治疗措施)、甲基强的松龙组[MP组:脊髓损伤后,首次30 mg/kg的剂量尾静脉内注射MP,之后5.4 mg/(kg·h)的剂量维持23 h]、过表达BDNF的ADSCs组(ADSCs/BDNF-GFP组：尾静脉注入BDNF基因转染的ADSCs 10 μl)和联合组(ADSCs/BDNF-GFP+MP组)。术后1，2，4周,比较各组大鼠后肢功能恢复情况(BBB评分)、脊髓组织中BDNF的表达情况和脊髓组织细胞的凋亡率。术后4周,检测脊髓组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。 结果 联合组的BBB评分和BDNF表达高于其余3组(P<0.05)。联合组凋亡率低于其余3组(P<0.05),Western blot结果显示联合组可以降低脊髓组织中Bax的含量,提高Bcl-2的含量。 结论 甲基强的松龙联合过表达BDNF的ADSCs有利于大鼠脊髓损伤功能的修复,可能与增加BDNF的表达和减少脊髓细胞的凋亡有关。

甲基强的松龙; 脑源性神经生长因子; 脂肪间充质干细胞; 脊髓损伤

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是由于车祸伤、坠落伤等创伤原因引起的脊髓横惯性损害,会导致损伤平面以下运动、感觉、括约肌及自主神经等功能障碍,造成患者中枢神经系统感觉运动功能不可逆性损伤,进而严重影响患者的生活质量[1,2]。SCI的治疗方法主要是手术减压和激素冲击,但这些方法效果有限[3]。近年来干细胞移植治疗SCI逐渐受到人们重视,其中最有潜力的是脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),ADSCs具有定向迁移分化的能力以及旁分泌神经营养因子的特点,为治疗SCI提供了新的思路[4,5]。然而,既往研究表明单纯使用ADSCs治疗SCI虽然有一定的效果,但距离预期效果相差甚远,究其原因在于:脊髓损伤局部免疫炎症反应导致移植迁移至损伤处的ADSCs难以存活;ADSCs分泌促神经修复因子的时间较短,导致修复效果受限[6-8]。甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)是治疗急性SCI的常用药物,可以有效抑制SCI局部的炎症反应[9]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作为一种神经生长因子,对于神经的修复、干细胞的存活及分化有着重要意义[10]。所以,本研究利用甲基强的松龙联合过表达BDNF的ADSCs治疗SCI,期待这种方法可以提高修复效果,为后期实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄雌性SD大鼠60只,清洁级,体质量200-250 g。其中48只用于SCI造模,12只用于提取ADSCs。动物由西安交通大学医学部动物实验中心提供,生产许可证号:SCXK(陕)08-018。本研究经西安交通大学医学部伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

pAdEasy-BDNF-GFP病毒液,由西安交通大学第一附属医院转化医学中心实验室构建;甲基强的松龙(辉瑞公司,美国,规格40 mg/支,批号:1005231),Ⅰ型胶原酶(Sigma,美国),TUNEL凋亡试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),RIPA蛋白提取液(武汉博士德生物工程有限公司),β-actin、Bcl-2、Bax抗体(Abcam公司,美国),ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒及定量试剂盒(Takara公司,日本),倒置相差显微镜(Olympus,日本,型号:CKX53);数码显微照相系统(Nikon公司,日本,型号:DS-Ri1-U2)。

1.3 ADSCs分离与培养

参照课题组前期获得ADSCs的实验方案[11,12]:戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉SD大鼠,无菌切取脂肪组织,剪碎,移至50 ml离心管中,加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃、150 r/min震荡消化50 min,加入含20%FBS的DMEM/F12终止消化,2 700 r/min离心10 min,弃上清,加入PBS,吹打均匀;用200目滤网过滤,以1 600 r/min离心10 min,沉淀物用DMEM/F12培养液重悬,以1×105个/ml的细胞密度接种于25 cm2培养瓶中,置入CO2孵育箱中,细胞融合达90%后,按1 ∶3的比例传代。此时的细胞称为第1代细胞。

1.4 pAdEasy-BDNF-GFP感染ADSCs

参照宋晨阳等的实验方法[13]:取第3代ADSCs,按照1×106个/孔的密度接种于48孔板中,培养2 d,移除培养液,取pAdEasy-BDNF-GFP病毒液(实验组)和pAdEasy-GFP病毒液(对照组),各制备成1×105,1×106,1×107,1×108,1×109,1×1010PFU/ml 6种不同滴度的病毒滴度,每种滴度病毒液加入4孔,另设4孔作为空白对照,细胞于孵箱内继续培养48 h,定期检测转染率并确定最佳病毒滴度。本实验的最佳病毒滴度为1.25×1010PFU/ml。

1.5 脊髓损伤模型的建立与动物分组

参照陈霄雷等[14]制作大鼠脊髓损伤打击模型。造模成功后,将大鼠随机分为4组,每组12只(ADSCs密度均为1×106/ml)。对照组:SCI后不给任何处理措施;MP组:首次30 mg/kg的剂量尾静脉内注射MP,之后5.4 mg/(kg·h)的剂量维持23 h;BDNF转染ADSCs组(ADSCs/BDNF-GFP):尾静脉注入BDNF基因转染的ADSCs 10 μl;联合组:MP+ADSCs/BDNF-GFP。

1.6 术后大鼠后肢功能恢复情况评估(BBB评分)

术后1,2,4周对大鼠活动进行记录,根据后肢体位、活动范围、活动方式等进行BBB评分。评分越高说明大鼠运动功能恢复越好,完全正常为21分,没有功能为0分,可以间接反映大鼠脊髓损伤后功能的恢复情况。

1.7 BDNF mRNA的表达检测

术后1,2,4周,各组取3只SD大鼠断颈处死,提取脊髓总RNA,使用ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒合成cDNA。BDNF引物:5′-CTACGAGACCAAGTGCAATCC-3′(上游);5′-AATCGCCAGCCAATTCTCTTT-3′(下游)。β-actin引物:5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′(上游);5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′(下游)。使用SYBR®Green Real-time PCR Master Mix试剂盒进检测。采用2-ΔΔCt法对数据进行统计处理。

1.8 TUNEL检测脊髓组织细胞凋亡

术后1,2,4周各组取出3只SD大鼠,切取包括脊髓损伤处上下各1 cm的组织,放置于4%的多聚甲醛中固定2 d,梯度脱水后,石蜡包被切片。TUNEL染色具体步骤按照试剂盒说明书进行,阳性细胞的细胞核呈棕色。细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/镜下细胞总数×100%。

1.9 Western blot检测Bcl-2、Bax及NSE的相对表达量

术后4周,各组取出3只SD大鼠,切除包括脊髓损伤处上下各1 cm的脊髓组织,RIPA裂解液提取脊髓总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取各组等量(50 μg)总蛋白在SDS-PAGE上电泳,之后转移到硝酸纤维膜上。5%去脂奶粉封闭2 h,一抗β-actin、Bcl-2和Bax(1 ∶10 000稀释)4 ℃孵育过夜,按1 ∶10 000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育,曝光洗片后,用Image Lab 8.0软件检测各组蛋白的相对表达量。

1.10 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 术后大鼠后肢功能恢复情况

术后1周,各组BBB评分差异无统计学意义(见表1)。术后2周和4周,MP组、ADSCs/BDNF-GFP组、联合组与对照组相比,BBB评分差异有统计学意义(P<0.05);联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,BBB评分差异有统计学意义(P<0.05);MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,BBB评分差异无统计学意义。4周时,联合组BBB评分升高到12.12±1.11。

表1术后大鼠后肢功能恢复(BBB评分)情况

Table1Functionalrecovery(BBBscores)ofhindlimbsafteroperation

分组n术后1周 术后2周 术后4周 对照组12050±002083±018#△192±043#△MP组12058±011233±027∗598±077∗ADSCs/BDNF⁃GFP组12061±008275±015∗611±071∗联合组12072±010475±011∗#△1212±111∗#△

与对照组相比,*P<0.05;与MP组相比,#P<0.05;与ADSCs/BDNF-GFP组相比,△P<0.05

2.2 术后BDNF表达情况

术后1周,与对照组相比,ADSCs/BDNF-GFP组和联合组差异有统计学意义(P<0.05);联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,BDNF表达差异有统计学意义(P<0.05);MP组与ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。术后2周和4周,MP组、ADSCs/BDNF-GFP组、联合组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异有统计学意义(P<0.05);MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异无统计学意义(见表2)。

表2术后各组BDNF表达量情况

Table2ExpressionofBDNFineachgroupatdifferenttimeafteroperation

分组n术后1周 术后2周 术后4周 对照组3021±002△016±003#△007±001#△MP组3025±004△051±004∗039±004∗ADSCs/BDNF⁃GFP组3085±007∗#062±003∗043±011∗联合组3111±004∗#△125±028∗#△194±021∗#△

与对照组相比,*P<0.05;与MP组相比,#P<0.05;与ADSCs/BDNF-GFP组相比,△P<0.05

2.3 各组凋亡率的比较

术后1周,各组凋亡率差异无统计学意义(见表3)。术后2周和4周,MP组、ADSCs/BDNF-GFP组、联合组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其中4周时,联合组细胞凋亡率进一步下降到6.13±2.73(见图1);MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异无统计学意义。

表3各组脊髓凋亡率比较(%)

Table3Comparisonoftheapoptosisrateamongfourgroups(%)

分组n术后1周 术后2周 术后4周 对照组32858±2264032±769#△2764±330#△MP组32536±1382015±232∗1429±004∗ADSCs/BDNF⁃GFP组32632±2152125±003∗1326±218∗联合组32412±3211725±165∗#△613±273∗#△

与对照组相比,*P<0.05;与MP组相比,#P<0.05;与ADSCs/BDNF-GFP组相比,△P<0.05

A.对照组;B.MP组;C.ADSCs/BDNF-GFP组;D.联合组;箭头为阳性细胞,胞质呈棕褐色图1 术后4周各组脊髓组织细胞凋亡TUNEL染色(×200)Figure 1 TUNEL staining of cell apoptosis in each group at 4 week after operation (×200)

2.4 各组凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比较

术后4周,Western blot结果显示,MP组、ADSCs/BDNF-GFP组、联合组Bax的表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);其中,联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,Bax的表达量较低,差异有统计学意义(P<0.05);MP组与ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异无统计学意义。

MP组、ADSCs/BDNF-GFP组、联合组Bcl-2的表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05，见图2);其中,联合组与MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,Bcl-2的表达量较高,差异有统计学意义(P<0.05);MP组和ADSCs/BDNF-GFP组相比,差异无统计学意义(见图2)。

与对照组相比,*P<0.05图2 术后4周各组Bax以及Bcl-2蛋白表达Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 proteins in each group at 4 week after operation

3 讨论

SCI主要包括原发性损伤(机械性创伤)和继发性损伤(缺血、缺氧、自由基的形成)[16]。目前,治疗SCI主要集中于减轻继发性损伤,防止并发症的发生,治疗原则包括以下几方面:①减少神经元细胞的死亡;②抑制胶质瘢痕增生;③促进轴突生长;④抑制免疫炎症反应;⑤促进再生轴突建立功能性突触;其中治疗的关键是抑制免疫炎症反应和减少神经元的死亡[17,18]。近年来干细胞移植治疗SCI逐渐成为研究热点,干细胞具有归巢能力,可以迁移至损伤处,在微环境下分化为神经元,从而代替死亡的神经元;可以分泌神经生长因子,改善局部微环境,从而有利于轴突生长[19,20]。但是,既往研究表明,单一使用干细胞治疗SCI效果不佳,分析原因在于:①SCI局部存在免疫炎症反应,导致迁移至损伤处的干细胞难以从活；②干细胞分泌神经生长因子量较少,难以满足SCI修复需求[21]。

甲基强的松龙(MP)治疗急性SCI是临床常用且公认的治疗方案,伤后8 h内,首次30 mg/kg静脉推注,继以5.4 mg/(kg·h)的剂量维持23 h,主要作用机制为减少氧自由基形成,抑制脂质过氧化反应,减轻细胞水肿和炎症反应,逆转细胞内Ca2+凝聚[22,23]。BDNF可以作用于感觉神经元、小脑神经元、运动神经元、海马区的神经元以及视网膜节细胞等,是最为常见的一种神经生长因子;刘志刚等[24]在其实验中证实腺病毒介导hBDNF修饰BMSCs静脉移植治疗大鼠SCI,能促进神经结构的修复及神经功能的恢复。康德智等[25]用BDNF转染ADSCs治疗SCI,发现转染后的干细胞可以迁移到损伤部位分化为神经元,与此同时他们认为BDNF的高表达是ADSCs向神经元样细胞分化的重要原因。基于此,我们将MP联合过表达BDNF的ADSCs移植治疗SCI,期待可以提高SCI的修复效果。

本研究中,术后2周和4周,联合组的BBB评分高于其余三组(P<0.05),表明联合组可提高SCI后动物肢体的运动能力;联合组的凋亡率低于其余三组(P<0.05),表明联合组可以降低SCI后细胞凋亡率。术后4周Western blot结果显示联合组可以降低Bax的含量,提高Bcl-2的含量,进一步验证了MP联合ADSCs/BDNF-GFP可以降低脊髓细胞的凋亡率。另外,术后1,2,4周,联合组BNDF表达高于ADSCs/BDNF-GFP组(P<0.05),这是因为联合组中的MP可以减轻局部免疫炎症反应,使得迁移至损伤处存活的干细胞增多,从而使得BDNF表达量增多。1周时,ADSCs/BDNF-GFP组BDNF表达高于MP组(P<0.05),2周和4周时二者差异无统计学意义,这是由于经腺病毒转染的ADSCs,仅能实现BDNF一过性呈高表达,随着时间的推移BDNF表达逐渐减弱。由上可知,联合组BBB评分高,BDNF表达高,凋亡率低,对照组评分低,BDNF表达低,凋亡率高,这就说明联合组促进大鼠后肢功能的恢复可能与抗凋亡作用和BDNF过表达有关,分析其可能的机制如下:①MP可以减轻SCI局部的免疫炎症反应,使得迁移至损伤处存活的ADSCs的数量增加;②ADSCs过表达BDNF,一方面可以改善微环境,维持神经元存活,最大程度抑制SCI后神经细胞的凋亡,保护残存神经元的功能;另一方面可以促进ADSCs向神经元分化代替死亡神经元。

本研究证实甲基强的松龙联合过表达BDNF的ADSCs有利于大鼠SCI后功能的修复,其可能与增加BDNF的表达和减少脊髓细胞的凋亡有关,这一结果对于后期进一步研究SCI的修复机制有着重要意义。

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Roleofcombinationofmethylprednisoloneandadipose-derivedstemcells(ADSCs)overexpressingbrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)inthetreatmentofacutespinalcordinjuryofrats

JI Wenchen1,JIANG Wanting2,ZHANG Dangfeng1,FENG Jiao1,HAN Yahong1,LI Meng1*(1

DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliat-edHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofUltrasoundDiagnosis,theFourthHospitalofXi'an;*Correspondingauthor,E-mail:drleemon@163.com)

ObjectiveTo evaluate efficacy of the combination of methylprednisolone(MP) and adipose-derived stem cells(ADSCs) with over-expressed brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in the treatment of acute spinal cord injury of rats.MethodsForty-eight rat models with spinal cord injuries were divided into four groups: control group (spinal cord was cut off but not treated), methylprednisolone(MP) group, ADSCs with over-expressed BDNF(ADSCs/BDNF-GFP) group and combination group(ADSCs/BDNF-GFP+MP group). The rats were injected with the first dose of 30 mg/kg MP into the caudal vein after spinal cord injury and then 5.4 mg/(kg·h) MP for 23 h in MP group. The rats were injected with 10 μl of ADSCs transfected with BDNF via caudal vein in ADSCs/BDNF-GFP group. The functional recovery of the hind limbs(BBB scores),BDNF expression in the spinal cord tissues and the cell apoptosis rate in the spinal cord tissues were compared at 1 week, 2 week and 4 week after the operation. Expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected at 4 week after the operation.ResultsBBB scores and BDNF expression in combination group were higher than those in the other three groups(P<0.05). The apoptosis rate was lower in combination group than in the other three groups(P<0.05). Western blot results showed that the expression of Bcl-2 was increased and the expression of Bax was inhibited in combination group.ConclusionThe combination of MP and ADSCs with over-expressed BDNF is favorable for functional recovery of rats with spinal cord injuries, which may be related to the increase of BDNF expression and the reduction of apoptosis of spinal cord cells.

methylprednisolone; brain-derived neurotrophic factor; adipose-derived stem cells; spinal cord injury

R681

A

1007-6611(2017)09-0908-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.009

西安市科技计划基金资助项目(2016050SF/YX06-1);西安交通大学第一附属医院院基金资助项目(2015YK27)

姬文晨,男,1985-05生,博士,主治医师,助理研究员,E-mail:jiwenchenbaoyan@163.com

2017-05-04