碱性成纤维细胞生长因子对大鼠急性脊髓损伤后内质网应激蛋白Caspase12表达的影响

赵 琳,贾鲲鹏,沈 娟,郝 琴,陈雅慧,杨彦玲*

(1延安大学医学院人体解剖学教研室,延安 716000;2延安大学附属医院儿科;*通讯作者,E-mail:yangyanling8889@163.com)

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠急性脊髓损伤后内质网应激蛋白Caspase12表达的影响

赵 琳1,贾鲲鹏2,沈 娟1,郝 琴1,陈雅慧1,杨彦玲1*

(1延安大学医学院人体解剖学教研室,延安 716000;2延安大学附属医院儿科;*通讯作者,E-mail:yangyanling8889@163.com)

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对大鼠急性脊髓损伤后内质网应激蛋白Caspase12表达的影响。 方法 90只8-10周 SD大鼠随机分为假手术组(sham)、急性脊髓损伤(SCI)组和bFGF治疗组(SCI+bFGF),分别于损伤后12 h，1 d，3 d，7 d和14 d,采用Rivlin斜板试验评估大鼠运动功能;采用TUNEL法检测神经细胞凋亡,免疫组化法观察受损节段脊髓组织中Caspase12的表达。 结果 SCI组和SCI+bFGF组各个时间点斜板度数均值与sham组比较,差异有统计学意义(P<0.01);SCI+bFGF组Rivlin斜板试验角度7 d(36.30°±2.82°)、14 d(46.50±2.98)与SCI组7 d(28.20°±2.78°)、14 d(33.30°±2.88°)比较,差异有统计学意义(P<0.05,0.01);SCI组较sham组细胞凋亡增加[(14.20±2.12)%vs(2.35±0.62)%,P<0.01],SCI+bFGF组[(10.32±1.68)%]较SCI组细胞凋亡减少(P<0.01);Caspase12的表达SCI组较sham组升高(12.20±1.02vs2.10±0.20,P<0.01),SCI+bFGF组(7.50±0.60)较SCI组降低(P<0.01)。 结论 急性脊髓损伤后Caspase12的表达明显升高,bFGF对Caspase12的表达具有抑制作用。

bFGF; 脊髓损伤; 内质网应激; 细胞凋亡

脊髓损伤是中枢神经系统的严重创伤,可造成损伤平面以下运动、感觉等不完全或完全丧失,导致脊髓相关神经功能障碍甚至截瘫,给家庭和社会带来沉重的经济负担。脊髓损伤可由原发性损伤和继发性损伤两种不同机制引起[1],对继发性损伤进行干预并促进神经功能修复是脊髓损伤后治疗成功的关键[2]。脊髓神经元细胞凋亡是继发性脊髓损伤加重的主要原因,既往研究认为死亡受体途径和线粒体依赖途径可以诱导继发性脊髓损伤的细胞凋亡[3],近年发现内质网应激通路也可以介导神经细胞凋亡,而Caspase12是内质网应激特有的凋亡途径[4]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子家族的重要成员,在创伤愈合、组织修复与再生等方面有重要作用[5],尤其在神经损伤修复方面备受人们关注。Lee等[6]研究表明,成年大鼠脊髓挫伤后,持续髓内灌注bFGF,脊髓损伤区明显减少。Rabchevsky等[7]选用蛛网膜下腔置管,微量泵连续给予外源性bFGF 1周,发现脊髓损伤大鼠运动功能有明显恢复。说明bFGF可以促进脊髓损伤的修复,但其机制如何,bFGF是否通过抑制内质网应激诱导细胞凋亡,发挥对脊髓损伤的保护作用鲜有报道。我们推测bFGF可能通过抑制神经细胞中Caspase12的表达,阻断内质网应激,减轻细胞凋亡,从而发挥脊髓损伤后的神经保护作用。本研究拟通过观察bFGF对大鼠急性脊髓损伤后内质网应激蛋白Caspase12表达及脊髓细胞凋亡的影响,探讨bFGF对急性脊髓损伤后神经细胞保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠90只,8-10周龄,SPF级,体质量220-240 g,雌性,由延安大学医学院中心实验室提供,许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2 主要试剂

bFGF(英国abcam),兔抗Caspase12(英国abcam),抗兔生物素化二抗(深圳欣博盛生物科技有限公司),链亲和素标记HRP(深圳欣博盛生物科技有限公司),TUNEL试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 制备大鼠脊髓损伤模型

2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉大鼠,制备大鼠急性脊髓打击损伤模型,采用HI-0400脊髓打击器,损伤力度200 kdyn/cm2,造成大鼠脊髓不完全损伤。损伤区以下经蛛网膜下腔置入PE10细导管至脊髓损伤远端约1 cm处,以1-0丝线依次缝合切口,丝线牢固固定导管。脊髓损伤模型造模成功标准:被打击后,脊髓损伤处出血、水肿,大鼠出现摆尾反射、躯体及双下肢回缩样扑动,双下肢呈弛缓性瘫痪。术后死亡及置管脱出的继续造模予以补充。术后常规腹腔注射青霉素钠20万U/kg,每日膀胱按摩2次至大鼠自主排尿反射建立。

1.4 动物分组及给药方法

SD大鼠随机分成假手术组(sham)、bFGF治疗组(SCI+bFGF)和急性脊髓损伤组(SCI)3组,sham组只打开椎板暴露脊髓,不进行打击;SCI+bFGF组术后即刻及每天以微量注射器经导管注入bFGF 20 μl,7 d后每周1次;SCI组相同时相点给予等量生理盐水;三组又各分为12 h,1 d,3 d,7 d,14 d 5个亚组(每组6只)。

1.5 脊髓组织取材

各组大鼠于不同时间点麻醉,固定,暴露心脏,自升主动脉快速灌注100 ml生理盐水,再用4%多聚甲醛400 ml灌注固定至僵硬,以损伤中心上下各1.5 cm取脊髓组织3 cm,置于4%多聚甲醛后固定24 h,脱水、石蜡包埋、切片,片厚约5 μm。用于TUNEL染色和免疫组化染色。

1.6 Rivlin斜板试验评估大鼠运动功能

在斜板表面垫上约5 mm厚的橡胶垫,放大鼠于斜板上,身体轴线与斜板纵轴垂直,逐渐增加斜板与水平面之间的夹角,记录大鼠刚好在斜板上停留5 s这一角度。每只大鼠每次测量3次。

1.7 缺口原位末端标记测定法(TUNEL)检测脊髓细胞凋亡指数

从每组随机抽取1张脊髓损伤组织切片进行TUNEL染色。切片脱蜡入水,用3%H2O2室温孵育10 min,接着1 ∶200蛋白酶K 37 ℃孵育10 min,在切片上滴加脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)及标记液,光镜下控制DAB呈色,TUNEL阳性细胞的胞核呈棕黄色,计算凋亡指数并取均值,凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100。

1.8 免疫组化染色检测Caspase12表达

切片经脱蜡、水化、3%H2O2处理、0.01 mol/L柠檬酸缓冲液95 ℃抗原修复20 min,室温下自然冷却,山羊血清封闭30 min,加兔抗Caspase12 IgG(1 ∶250,Abcam)37 ℃孵育1 h、抗兔生物素化二抗(即用型,欣博盛)37 ℃过夜、链亲和素标记HRP(即用型,欣博盛)37 ℃孵育30 min,DAB显色,苏木素复染5 min,0.1%盐酸酒精分化,脱水、透明和封片。光学显微镜下观察脊髓组织阳性细胞呈现棕褐色。每组选取3张不连续切片,统计每单位面积内(mm2)Caspase12阳性细胞数。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 三组大鼠不同时间点Rivlin斜板实验临界度数均值比较

SCI组和SCI+bFGF组各个时间点斜板临界度数均值与sham组比较,差异有统计学意义(P<0.01);术后12 h，1 d和3 d,SCI+bFGF组和SCI组斜板临界度数的均值比较,差异无统计学义;术后7 d, SCI+bFGF组斜板临界度数高于SCI组,差异有统计学意义(P<0.05);术后14 d,SCI+bFGF组比SCI组高(P<0.01,见表1),而且增加更为明显。

组别12h 1d 3d 7d 14d sham组6300±06300±06300±06300±06300±0 SCI组 880±110∗1960±212∗2450±252∗2820±278∗3330±288∗ SCI+bFGF组 890±120∗2210±236∗3020±263∗3630±282∗#4650±298∗##

与sham组比较,*P<0.01;与SCI组比较,#P<0.05,##P<0.01

2.2 脊髓细胞TUNEL染色结果

观察三组7 d时的细胞凋亡情况发现,SCI组存在大量阳性凋亡细胞,其凋亡指数为(14.20±2.12)%,较sham组[(2.35±0.62)%]明显增多(P<0.01),而SCI+bFGF组[(10.32±1.68)%]较SCI组细胞凋亡有所减轻(P<0.01,见图1)。

2.3 Caspase12免疫组化结果

给予bFGF 7 d后发现,Caspase12在sham组仅有少量阳性细胞表达,SCI组Caspase12阳性细胞[(12.20±1.02)个]较sham组[(2.10±0.20)个]明显增多(P<0.01),在脊髓灰质散在分布,以神经元细胞为主,免疫阳性细胞胞浆呈棕褐色,细胞核也呈现不同程度棕褐色(见图2);SCI+bFGF组[(7.50±

0.60)个]阳性细胞数较SCI组减少(P<0.01)。

与sham组比较,*P<0.01;与SCI组比较,#P<0.01图1 脊髓损伤后三组细胞凋亡指数比较Figure 1 Comparison of cellular apoptosis index after spinal cord injury in three groups

A.sham组 B.SCI组 C.SCI+bFGF组图2 脊髓损伤后三组Caspase12阳性细胞表达比较Figure 2 Effect of bFGF on Caspase12 expression after acute spinal cord injury

3 讨论

目前对于继发性脊髓损伤的机制研究主要有钙离子学说、自由基损伤学说、电解质失衡学说、细胞凋亡学说等,其中细胞凋亡学说被认为是继发性脊髓损伤的一种重要机制。内质网信号通路是近年发现的介导神经细胞凋亡的新途径,钙超载、氧化应激及大量自由基生成等也是诱导内质网应激发生的刺激因素,当严重持续的内质网应激损伤内质网功能时,可能引起凋亡通路激活,内质网应激与脊髓继发性损伤关系密切[8]

Caspase12是内质网外膜上的组成性蛋白,一种半胱天冬酶,激活前以酶原的形式存在,是介导内质网应激凋亡的关键因子[4]。在发生内质网应激时,经过特定位点裂解激活,Caspase12表达增加并活化,其机制可能与IRE1、Caspase7和m钙蛋白酶三条途径有关[9],进而激活与细胞凋亡相关的caspase级联反应,引起细胞凋亡[10]。由于Caspase12在内质网应激细胞凋亡信号转导中的特殊位置,Caspase12是内质网应激引起细胞凋亡的一个代表性分子和标志性蛋白,在线粒体或死亡受体凋亡途径中不会被活化。

本研究中行为学评分采用Rivlin斜板实验,结果显示:sham组大鼠后肢运动功能状况和正常大鼠相似,可以在63°倾斜角的斜板上站稳至少5 s,经打击后的两组大鼠后肢均瘫痪,几乎无活动能力,说明采用本方法会造成大鼠后肢功能障碍,可以成功复制脊髓损伤动物模型。给予bFGF后,术后第7天发现SCI+bFGF组比SCI组大鼠后肢力量明显加强,14 d更为显著,说明bFGF可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。

TUNEL染色结果显示,sham组没有检测到明显的凋亡细胞,而脊髓损伤后检测到大量阳性凋亡细胞,给予bFGF干预后,凋亡细胞明显减少,提示bFGF可以通过减轻脊髓损伤后细胞凋亡的程度,对脊髓损伤起到一定的保护作用。进一步探求bFGF减轻细胞凋亡的机制,通过免疫组化分析Caspase12在脊髓组织的表达,脊髓损伤后检测到Caspase12阳性细胞大量表达,而bFGF可以降低Caspase12在脊髓组织的表达,说明Caspase12参与了细胞凋亡的过程,bFGF可能通过抑制Caspase12的活化,阻止细胞凋亡。表明bFGF对脊髓损伤的保护作用机制与抑制Caspase12介导的内质网应激密切相关。

综上所述,脊髓遭受创伤后,产生较为强烈的内质网应激,引起脊髓神经细胞的各种功能障碍,最后引起神经细胞凋亡。bFGF可以对急性脊髓损伤发挥神经保护作用,可能与其抑制内质网应激相关蛋白Caspase12的表达和脊髓神经细胞的凋亡有关。这将对临床应用bFGF治疗脊髓损伤提供有力的实验依据。

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EffectofbFGFonexpressionofendoplasmicreticulumstress-relatedproteinCaspase12afteracutespinalcordinjuryinrats

ZHAO Lin1,JIA Kunpeng2,SHEN Juan1,HAO Qin1,CHEN Yahui1,YANG Yanling1*(1

DepartmentofHumanAnatomy,MedicalCollegeofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yangyanling8889@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the expression of Caspase12 after acute spinal cord injury in rats.MethodsNinety rats were randomly divided into sham group, acute spinal cord injury(SCI) group and bFGF group(SCI+bFGF)at 8-10 week. At 12 h, 1 d, 3 d, 7 d and 14 d after acute spinal cord injury, the movement function was evaluated in rats by Rivlin inclined plate experiment, Neural cell apoptosis was examined by TUNEL staining and the expression of Caspase12 was detected in the damaged segments of the spinal cord by immunohistochemical staining.ResultsRivlin inclined plate experiment average angle showed significantly difference between SCI group, SCI+bFGF group and sham group at each time point(P<0.01). Rivlin inclined plate experiment average angle was significantly higher in SCI+bFGF group than in SCI group at 7 d(36.30°±2.82°vs28.20°±2.78°,P<0.05)and 14 d(46.50°±2.98°vs33.30°±2.88°,P<0.01). The cell apoptosis was significantly higher in SCI group than in sham group(14.20±2.12vs2.35±0.62,P<0.01), and it was lower in SCI+bFGF group(10.32±1.68) than in SCI group(P<0.01).The expression of Caspase12 was significantly higher in SCI group than in sham group(12.20±1.02vs2.10±0.20,P<0.01), and it was lower in SCI+bFGF group(7.50±0.60)than that in SCI group(P<0.01).ConclusionThe expression of Caspase12 increases after acute spinal cord injury in rats, and bFGF can inhibit the expression of Caspase12.

bFGF; spinal cord injury; endoplasmic reticulum stress; cell apoptosis

R363

A

1007-6611(2017)09-0904-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.008

国家自然科学基金资助项目(81641048,81650022);陕西省科技厅攻关基金资助项目(2013K12-01-23)；陕西省教育厅专项科学资助项目(17JK0873)

赵琳,女,1976-07生,硕士,副教授,E-mail:jkpzhaolin@163.com

2017-05-04