Box-Behnken效应面法优化半枝莲和白花蛇舌草药对中总黄酮的提取工艺*

时方方 闫 伟 高凤腾 王桂玲

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271000)

半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D Don的干燥全草，味辛微苦，全草入药。具有清热解毒、化瘀利尿的功效，可用于疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌打伤痛、蛇虫咬伤等，临床研究证明还具有抗肿瘤作用。主要含有黄酮类、多糖类、二萜类等成分[1-4]。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa willd[Oldenlandia d if f usa (Willd.) Rox b.]的干燥全草，性甘、寒、微苦，以全草入药，主要功效是清热、解毒、利湿。用于痈肿疮疖、肺热咳喘、毒蛇咬伤等，主要含有蒽醌类、黄酮类、生物碱类等成分[5-8]。半枝莲和白花蛇舌草同属清热解毒类中药，二者常以药对形式出现在各种临床应用中。黄酮类化合物作为两者主要的成分，近年来的研究证实具有抗菌消炎、清热解毒、抗氧化等疗效[9-10]。

本研究是以两者共有的黄酮类化合物作为研究对象，以总黄酮的提取率为考察指标，采用Box-Behnken效应面法优选半枝莲和白花蛇舌草药对中总黄酮的提取工艺，本研究为半枝莲和白花蛇舌草药对中黄酮类成分的进一步开发和应用提供了参考和依据。

1 仪器、材料和试剂

1.1仪器

SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵(上海科兴仪器有限公司)；KQ-5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-5200紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；MP-300D电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；HH-2数星恒温水浴锅(金坛市城东新瑞仪器厂)。

1.2材料和试剂

半枝莲(山东晟银多宝中药饮片科技有限公司)；白花蛇舌草(亳州市中正中药材饮片有限公司)；芦丁标准品(批号16031813，纯度98%，中国百欧博伟生物技术有限公司)；三氯化铝(上海广诺化学科技有限公司)；水为纯净水，其它试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1含量测定

2.1.1对照品溶液的制备

精密称量芦丁对照品2 mg，甲醇溶解定容至10 ml量瓶中，配成浓度为0.2 mg·ml-1的溶液，备用。

2.1.2三氯化铝溶液的制备

称取适量三氯化铝蒸馏水溶解定容至500 ml量瓶中，制成5%的三氯化铝溶液，备用。

2.1.3测定波长的选择

量取“2.1.1”项芦丁对照品溶液1 ml,置于25 ml量瓶中，加入3 ml三氯化铝溶液，甲醇定容，摇匀，静置10 min，以不加对照品的溶液做为空白，在紫外分光光度仪上200～600 nm波长范围内扫描，结果显示对照品溶液在414 nm出现最大吸收，因此确定最大吸收波长为414 nm。

2.1.4标准曲线的绘制

精密移取“2.1.1”项芦丁对照品溶液0 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml分别置25 ml量瓶中，各加入3 ml三氯化铝溶液，甲醇定容，摇匀，静置10 min，以不加对照品的溶液作空白，在414 nm处测定吸光度。以溶液的浓度C为横坐标, 吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。得回归方程A=29.313C+0.005 R2=0.9996，表明芦丁在0.0064～0.0128 mg·ml-1范围内呈良好的线性关系。

2.2单因素实验

2.2.1不同配比的考察

将半枝莲和白花蛇舌草以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3不同比例分别称取3 g，分别置于已编号的圆底烧瓶中，各加入20倍量体积分数为70%的乙醇，回流提取1.5 h。抽滤，滤液加水定容至100 ml量瓶中，混匀，移取适量溶液于坩埚中，蒸干，少量甲醇超声溶解，转移至25 ml量瓶中，再加3ml的三氯化铝溶液，甲醇定容至刻度，静置10 min，在414 nm处测定吸光度。按“2.1.4”项标准曲线计算含量。结果如图1所示。

图1 不同配比对提取率的影响

从图1可以看出，半枝莲和白花蛇舌草配比不断发生变化时，提取率呈明显的下降趋势，当配比为3∶1和2∶1时，提取率都很高。但考虑到两者在药对中比例的均衡，故选择半枝莲和白花蛇舌草配比为2∶1。

2.2.2乙醇体积分数的考察

在确定配比(2∶1)的条件下称取半枝莲和白花蛇舌草7份，每份3 g，分别置于已编号的圆底烧瓶中，各加入20倍量体积分数为35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”项。结果如图2所示。

图2 乙醇体积分数对提取率的影响

从图2可以看出，随着乙醇体积分数的增加，黄酮的提取率呈现出先增加后下降的趋势，在体积分数为75%时达到最大，所以选择体积分数为75%的乙醇作为提取溶剂。

2.2.3料液比的考察

按配比(2∶1)称取半枝莲和白花蛇舌草6份，每份3 g，分别采用15、20、25、30、35、40倍量的75%乙醇，回流提取1.5 h。余下操作同“2.2.1”项。结果如图3所示。

从图3可以看出，随着料液比倍数的增加，黄酮提取率也随之增加，但当料液比为25倍量后，增加幅度不明显，故选择料液比25倍量的为宜。

2.2.4提取时间考察

按配比(2：1)称取半枝莲和白花蛇舌草6份，每份3 g，采用25倍量的75%乙醇，分别提取0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，余下操作同“2.2.1”项。结果如图4所示。

从图4可以看出，随着提取时间的延长，黄酮提取率呈增加的趋势，但当提取时间达到2 h后，增加幅度不明显，故选择提取时间为2h。

2.3Box-Behnken效应面法优化总黄酮的提取工艺

2.3.1设计方案与实验结果

采用软件Design-Expert8.05b中Box-Behnken实验设计模块，综合单因素考察的结果，选取配比(A)、乙醇体积分数(B)、料液比(C)、提取时间(D)四个较为显著的因素为自变量进行优化，每个因素设3个水平，分别用-1、0、1表示，以总黄酮的提取率(Y，mg·g-1)作为评价指标，具体的实验设计方案及结果如表1、2所示。

表1 实验设计自变量、水平表

表2 实验设计结果

表3 方差分析结果

2.3.2数据处理及模型拟合

利用Design-Expert8.05b软件对上述表格中的数据分析，以总黄酮提取率为因变量，对作为自变量的因素(A、B、C、D)进行二项式拟合，得到回归方程Y=24.07+3052A-0.80B+0.92C+1.86D-0.50AB+0.69AC+0.49AD-1.06BC+0.12BD-1.07CD+0.72A2+0.31B2-0.17C2+1.50D2，R2=0.9878，由方程的相关系数可以看出，因变量和自变量拟合的二项式方程相关系数较高，拟合效果好。其方差(如表3所示)分析表明该模型具有显著性(P<0.001)，失拟效果不显著，各个因素的一次方对模型有显著的影响。数据分析结果表明该拟合的方程的模拟效果较好，可以用于不同条件下的结果预测。

图3 料液比对提取率的影响

图4 提取时间对提取率的影响

2.3.3提取工艺的响应面法分析及其优化

采用Design-Expert8.05b软件，根据拟合的二项式方程，绘制总黄酮提取率随因素变化的等高线图，以确定最佳的提取工艺条件。结果如图5～8所示。从各因素的等高线图5～8可以看出，配比、乙醇体积分数、料液比和提取时间对总黄酮提取率的影响基本呈一次关系，其中配比随着半枝莲所占比例的增加，总黄酮提取率呈现出增加的趋势；乙醇体积分数随着体积分数的增加，呈现出下降的趋势；料液比随着倍数的增加也呈现出增加的趋势；提取时间随着时间的延长也呈现出增加的趋势。

图5 配比对总黄酮提取率影响的等高线

图6 乙醇体积分数对总黄酮提取率影响的等高线

图7 料液比对总黄酮提取率影响的等高线

图8 提取时间对总黄酮提取率影响的等高线

结合软件中模型及相应的等高线图和曲面图的分析结果：半枝莲和白花蛇舌草总黄酮提取的最佳工艺参数为配比2.85∶1、乙醇体积分数为65.15%、料液比为1∶28.09，提取时间为2.49 h,提取率为33.5839 mg·g-1。

2.3.4验证实验

在此最佳工艺条件下进行验证实验(31.6467 mg·g-1、29.6025 mg·g-1、29.5457 mg·g-1，RSD=0. 51%，n=3)。平均提取率为30.2650 mg·g-1，与模型预测的结果接近，可以得到较高的总黄酮提取率，说明该模型可靠。

2.3.5提取次数的考察

称取半枝莲和白花蛇舌草共3 g，按照最佳工艺条件，配比2.85∶1，乙醇体积分数为65.15%，料液比为1∶28.09，回流提取2.49 h,提取率为33.5839 mg·g-1过滤，滤渣再加入相同体积的乙醇再提取一次，过滤，滤渣再加入相同体积的乙醇提取一次，共提取3次，每次滤液统一加蒸馏水定容到100 ml量瓶中，混匀，用移液管移取适量于坩埚中，蒸干，余下操作同“3.2.1”项。结果如图9所示。

图9 提取次数对提取率的影响

从图9可以看出，随着提取次数的增加，黄酮提取率呈明显下降的趋势，为了使提取完全以提取2次为宜。

2.3.6确定的提取工艺条件

综合以上分析，确定最佳的提取工艺条件为半枝莲和白花蛇舌草配比为2.85∶1，乙醇体积分数为65.15%，料液比为1∶28.09，回流提取2次，提取时间为2.49 h。在此条件下进行3次验证实验，3次测得的提取率接近。

3 讨 论

效应面法比正交实验法更简化比均匀设计更全面，试验精度高，并适用于多因素、多水平的试验。该设计法最大的优点是可对未做过的实验进行预测，但同时需要有丰富的专业知识和一定的预实验确定各因素的范围，现已广泛应用于药学研究领域。

Box-Behnken效应面法确定最佳的提取工艺条件为半枝莲和白花蛇舌草配比为2.85∶1，乙醇体积分数为65.15%，料液比为1∶28.09，回流提取2次，提取时间为2.49 h。Box-Behnken效应面法优选的提取工艺简便可行，预测效果好，可以得到较高含量的黄酮，有一定的应用前景。

[1] 郑永红，韦晓瑜，龙继红.半枝莲的研究进展[J].中草药，2010，41(8)：1406-1408.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化学工业出版社，2005 ：77-78.

[3] 张秀娟，杨珊珊.半枝莲化学成分及提取物抗肿瘤作用的研究现状[J].亚太传统医学，2008，4(8)：76-77.

[4] 杨连梅，刘量，胡荣，等.半枝莲化学成份的提取和含量测定方法的研究[J].江苏中医药，2010，42(2): 78-80.

[5] 纪宝玉，范重庆，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化学成份及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(19)：235-240

[6] 斯建勇，陈迪华，潘瑞乐，等.白花蛇舌草中苷类成分的研究[J].中草药，2008，39(4)：507-509.

[7] 刘盼盼，姚晓东，李洁.白花蛇舌草化学成分及药理作用研究进展.中国药业，2011，20(21)：96-97.

[8] 罗金强，刘宏斌.半枝莲、白花蛇舌草抗肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,22(02) : 481-484.

[9] 陈莉华，张烨，李三艳.半枝莲黄酮的超声提取及其抗氧化活性[J].生物加工过程，2013，11(4)：36-41.

[10] 吴杨，周忆新，吴银生.白花蛇舌草总黄酮的提取及体外对肝癌细胞的作用[J].抗感染药学，2008，5(3) : 150-152.