清补通络浓缩丸提取工艺优化研究*

清补通络浓缩丸是新疆维吾尔自治区第六人民医院的纯中药制剂，由黄芩、党参、丹参、赤芍、柴胡、黄芪、枳壳、防己、当归、独活、川芎、川牛膝、元胡、地龙、甘草等中药组方，具有补气扶正、活血化瘀、清热祛湿、通络止痛的功效，主要用于治疗布鲁氏杆菌病，症见乏力、神疲倦怠、发热、关节肿胀疼痛、肌肉酸痛等。该药起初为水丸，后为方便患者携带和服用，以及减少服用剂量，改为浓缩丸。本研究中将清补通洛丸中除丹参、赤芍、枳壳、元胡外的其他11味药进行提取，纳入每次提取时间、提取次数、料液比等多个因素，设计正交试验，并以浸膏得率和浸膏中的黄芩苷含量为考察指标，探讨清补通络浓缩丸最佳提取工艺，为其制剂试生产和质量控制标准的研究提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC20－10A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ5200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE－3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA2204型电子秤（常州市幸运电子设备有限公司）；WS70－1型红外干燥箱（巩义市英峪予仪器厂）；优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）；AS265－S型电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；AP－01P型真空泵（天津欧特塞恩斯仪器有限公司）。

试药：蒸馏水；色谱甲醇（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；乙醇（天津市致远化学试剂有限公司，分析纯）；甲醇（分析纯）、磷酸均购自天津市百世化工有限公司；黄芩苷对照品（批号为110715－201318，中国食品药品检定研究院）；当归（批号为 16030401－3）、黄芪（批号为 15082801－8）、党参（批号为 16033302－5）、丹参（批号为 16070101－1）、赤芍（批号为 15082901－5）、柴胡（批号为 16032501－2）、黄芩（批号为 15121502－2）、防 己 （批 号 为 16010501－3）、独 活 （批 号 为16042702 － 1）、川芎（批号为 16051001－4）、枳壳(批号为15111201－5)、川牛膝（批号为 16011101－5）、元胡（批号为 15061402 － 4）、地龙（批号为 15121105）、甘草（批号为16021701－4）中药材均购于新疆奇康哈博中维药饮片有限公司。

2 方法与结果

2．1 黄芩苷含量测定

2．1．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Luna C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水 － 磷酸（47 ∶53 ∶0．2）；检测波长：280 nm[5]；流速：1 mL ／min；柱温：30 ℃ 。色谱图见图 1。可见，阴性对照品溶液在黄芩苷出峰位置处未出现吸收峰，表明处方中其他药材对黄芩苷的含量测定无干扰。

2．1．2 溶液制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇制成质量浓度为 94．6 μg／mL的溶液，即得对照品溶液。按处方比例取11味中药材，粉碎，过3号筛，称取5 g，精密称定，置圆底烧瓶，加入50 mL蒸馏水，回流提取1 h，提取1次，滤过，滤液蒸干，残渣加入70%乙醇 50 mL，称定质量，超声 30 min，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液2．5 mL，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。取样品适量，加入相应量对照品溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。按处方比例取除黄芩以外所有药材，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2．1．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品溶液 0．4，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液。按2．1．1项下条件测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝33 894X－1 614．2，r＝0．999 9（n＝5）。结 果 表明 ，黄 芩 苷 质 量 浓 度 在3．78 ～ 75．68 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，重复连续进样6次，每次10 μL。结果峰面积平均积分值为3 109 045，RSD为2．63%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：称取6份样品，依法制备供试品溶液并测定。结果平均含量为 4．21 mg／g，RSD 为 2．71%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，16，24 h时精密吸取并进样，依法测定。结果平均峰面积为 1 459 199，RSD 为 2．07% （n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：称取已知黄芩苷含量的清补通络浓缩丸适量，精密称定，按供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别精密加入含黄芩苷3．259 2 mg对照品溶液，依法测定，计算回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

2．2 正交试验优选

本试验中，以因素 A（料液比，V∶V），因素 B（每次提取时间），因素C（提取次数）为考察因素进行正交试验，具体设计及结果见表2至表4。

由表3可见，料液比及提取次数对检测指标影响较大，各因素对提取中黄芩含量的影响程度依次为提取次数＞料液比＞提取时间，因素A中 K3＞K2＞K1，故选择水平 3，即料液比为 1∶10（V∶V）；因素 C 中 K2＞ K3＞ K1，应选择水平2，即提取2次；每次提取时间对检测指标影响不大，为方便起见，选择每次提取1 h。由表4可见，料液比和提取次数在黄芩苷含量测定中具有显著性。综合考虑，确定最佳提取工艺为料液比为1∶10，提取2次，每次提取1 h。对优选的提取工艺进行验证，测得黄芩苷含量为 4．49 mg ／g，出膏率为 4．89% ，基本合格。

3 讨论

清补通络浓缩丸已广泛用于临床，对治疗布鲁氏杆菌病起到了积极作用。该病是由布鲁氏杆菌侵入机体后引起的变态反应性传染病[1]，可引起多种局部并发症，如外周关节炎、心力衰竭、流产等，致使布鲁氏杆菌病迁延难愈，成为临床治疗和控制的难点[2－3]。西医抗菌疗法用于急性期布鲁氏杆菌病，毒副作用较大，复发率较高，不易杀死病菌[4－7]。中药主要治疗慢性期和部分急性期布鲁氏杆菌病，毒副作用较小、不易产生耐药，可改善机体免疫功能，能达到标本兼治的效果。

表1 黄芩苷加样回收试验结果（n＝6）

表2 影响因素与水平表

表3 提取工艺正交试验设计及直观分析表

表4 方差分析结果表

黄芩苷为方中黄芩的主要活性成分，具有抗肿瘤[8]、抗炎[9]、抗过敏[10]等作用，尤以抗菌作用最显著[11]。故本研究中采用高效液相色谱法测定提取液中黄芩苷含量，并计算浸膏得率，进行浓缩丸提取工艺优化研究[12－13]。正交试验方差分析结果表明，料液比及提取次数对检测指标影响较大，具有显著性，各因素对黄芩苷提取工艺的影响程度依次为提取次数＞料液比＞提取时间，得出最佳提取工艺。经验证，在此工艺下黄芩苷含量为4．49 mg／g，出膏率为4．84%，结果满意，且此工艺可操作性强，重复性好，实用性强，可为大生产提供依据。中药新药清补通络浓缩丸制剂工艺的初步研究，为后续其他中药新药的研究开发打下了坚实基础，可更好地服务于布鲁氏杆菌病患者，也有利于维护社会稳定，有显著的经济效益和社会效益，符合国家及新疆当地的民生政策，对推动我国布鲁氏杆菌病的防治工作具有非常重要的意义。

[1]王季秋．布鲁氏杆菌病病原学[J]．中国地方病防治杂志，2009，24（3）：206．

[2]吴冬玲．布鲁氏菌VirBS－PCR诊断方法的建立与应用及Ery基因的克隆与序列分析[D]．乌鲁木齐：新疆农业大学，2008．

[3]何凤田．布氏杆菌新型疫苗的构建及保护效果的研究[D]．重庆：中国人民解放军第三军医大学，2005．

[4]王季秋，崔京玉．布鲁氏菌病治疗研究进展[J]．中国地方病防治杂志，2007，22（2）：104 － 106．

[5]胡剑飞．布鲁菌的分离鉴定及omp31基因的克隆和序列分析[D]．呼和浩特：内蒙古农业大学，2010．

[6]尚德秋．布氏菌病研究进展[J]．中国地方病防治杂志，2004，19（4）：204 － 212．

[7]肖东楼，冶森林，王大力，等．布鲁氏菌病防治手册[M]．北京：人民卫生出版社，2008：9．

[8]洪 铁，杨 振，绳 娟，等．黄芩苷抗肿瘤作用及机制的研究[J]．中国药理学通报，2008，24（12）：1676 － 1678．

[9]侯艳宁，朱秀媛，程桂芳．黄芩苷的抗炎机理[J]．药学学报，2000，35（3）：161 － 164．

[10]吴 梅，闫 慧，张春梅．黄芩苷作为一种抗生物制剂的过敏反应研究[J]．微生物学免疫学进展，2007，35（4）：48 － 50．

[11]陈丽平．黄芩有效化学成分及抑菌作用的研究分析[J]．中国实用医药，2011，6（10）：167．

[12]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2015：301－302．

[13]陈克克，王吉吉之．党参多糖的研究进展[J]．现代生物医学进展，2007，7（4）：635 － 636．