反相高效液相色谱法测定酚氨咖敏片的含量及其均匀度

王丽琼

（四川省乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

酚氨咖敏片主要适用于感冒、发热、头痛、神经痛及风湿痛等，其为复方制剂，主要成分为氨基比林、对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏，价格便宜，文献报道的不良反应有肝损害[1]、白细胞减少[2]、严重皮疹[3]等，还存在主要成分对乙酰氨基酚的安全性问题[4]。现行标准[5]中采用高效液相色谱（HPLC）法分别测定上述4种成分的含量，氯苯那敏出峰时间约为23 min，对乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分离度差，且操作烦琐，耗时长。有人采用HPLC法同时测定酚氨咖敏颗粒中上述4种成分的含量[6]，以及酚氨咖敏片中咖啡因与马来酸氯苯那敏的含量均匀度[7]，但均仅洗脱出马来酸峰，未洗脱出氯苯那敏峰。还有人采用HPLC法测定酚氨咖敏片中氨基比林、对乙酰氨基酚和咖啡因的溶出度[8－9]，以及马来酸氯苯那敏含量均匀度[10]，采用气相色谱（GC）法同时测定酚氨咖敏片中4种成分的含量[11]，采用近红外漫反射光谱法测定酚咖片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量[12]。但尚未见采用HPLC法同时测定酚氨咖敏片4种主要成分含量及其均匀度的报道。本研究中采用常用的C18柱和简单的二元流动相，以梯度洗脱提高分离性能，建立了能同时测定酚氨咖敏片4种组分含量的质量控制方法，同时对咖啡因和马来酸氯苯那敏的含量均匀度进行了考察。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，含二极管阵列检测器和OpenLAB CDS色谱工作站（美国Agilent公司）；XS205 DualRange型电子天平，SevenMulti型酸度计（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1．2 试药

氨基比林对照品（批号为100503－201302，纯度为99．9%），对乙酰氨基酚对照品（批号为 100018－201409，纯度按 99．9% 计），咖啡因对照品（批号为171215－201010，纯度按 100．0%计），马来酸氯苯那敏对照品（批号为 100047－201507，纯度按 99．7%计）均购自中国食品药品检定研究院；酚氨咖敏片（云南白药集团大理药业有限责任公司，批号分别为DLA1586，DHA1628，DMA1610）；甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸、糊精、羧甲淀粉钠、二氧化硅和硬脂酸镁均为分析纯，马铃薯淀粉为生物试剂，试验用水为纯化水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Waters XTerra® RP18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：A 为甲醇，B 为 0．02 mol／L 磷酸二氢钾溶液 － 三乙胺（100 ∶0．02），梯度洗脱（0～15 min，A 相20%→75%；15～16 min，A 相 75%→20%；16～21 min，A 相 20%）；流速：1．0 mL ／min；柱温：30 ℃ ；检测波长：215 nm；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

对照品溶液：称取氨基比林对照品100．36 mg，对乙酰氨基酚对照品 150．00 mg，咖啡因对照品 29．98 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇（用10%磷酸调节pH至3．5）溶解；精密称取马来酸氯苯那敏对照品10．84 mg，精密称定，置 25 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置上述50mL容量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取25 mL，置100 mL容量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

供试品溶液：取样品20片，称定，计算平均单片质量，称取适量（约相当于对乙酰氨基酚150 mg），置200 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

溶剂空白溶液：25%甲醇（用10%磷酸调节pH至3．5)。

阴性对照品溶液：按处方比例取空白辅料，同供试品溶液配制方法制备，即得。

图1 高效液相色谱图

2．3 方法学考察

阴性干扰试验：分别取2．2项下3种溶液及溶剂空白溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件测定，记录色谱图。结果见图1。在拟订色谱条件下，4个组分可完全分离。理论板数按对乙酰氨基酚峰计算为13 345；马来酸峰与对乙酰氨基酚峰的分离度为16．11，对乙酰氨基酚峰与咖啡因峰的分离度为5．52，咖啡因峰与氨基比林峰的分离度为14．63，氨基比林峰与氯苯那敏峰的分离度为13．44。结果表明，在拟订色谱条件下，4个测定组分（5个峰）分离好，溶剂和辅料在对照品溶液4组分（5个峰）相应保留时间处无色谱峰，阴性对照无干扰。

定量限确定：称取各组分对照品适量，精密稳定，加25%甲醇溶解并稀释制成氨基比林、对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏质量浓度分别为 0．25，0．37，0．15，1．08 μg／mL 的溶液，按 2．1 项下色谱条件进样分析。结果见表1。

线性关系考察：精密量取对照品贮备液 0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加 25%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取各溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以各组分峰面积（A）为纵坐标、质量浓度（C，μg／mL）为横坐标进行线性回归。结果见表1。

精密度试验：精密量取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。连续进样6次，测定峰面积。结果见表1，可见仪器精密度良好。

重复性试验：取批号为DMA1610的酚氨咖敏片样品，依法制备6份供试品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以样品中4组分标示量的百分含量计算。见表1。可见，方法重复性符合要求。

加样回收试验：精密称取氨基比林、对乙酰氨基酚和咖啡因的对照品及片剂中的其他组分，按处方量的100%，分别置6个200 mL容量瓶中，加适量25%甲醇溶解；精密称取马来酸氯苯那敏对照品20 mg，置50 mL容量瓶中，用25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，分别置上述相应的200 mL容量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，得每个组分6份供试品溶液。精密量取以上6种溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，计算加收率。结果见表2。

稳定性试验：取批号为DMA1610的样品，依法制备供试品溶液，室温放置，分别于 0，2，4，6，8，12，24，36，48 h精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。结果见表1，可见明供试品溶液在48 h内稳定。

耐用性试验[13]：取对照品溶液，分别采用不同柱温（29．0，29．5，30．0，30．5，31．0 ℃ ）和不同流速（0．990，0．995，1．000，1．005，1．010 mL ／min），其他条件同 2．1项，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。结果见表1，可见在测定条件有微小变动时，测定结果不受影响，系统耐用性好。

表1 方法学考察试验结果

表2 回收率试验结果（n＝6）

表3 样品含量测定结果（%，n＝3）

2．4 样品含量测定

取批号为DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各3份，依法制备供试品溶液。精密量取各溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算样品含量。结果见表3。

2．5 样品含量均匀度测定

取批号为DLA1586，DHA1628，DMA1610的酚氨咖敏片各1片，分别置200 mL容量瓶中，加适量25%甲醇，超声助溶，放冷，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取各溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，进样10次，记录色谱图。按外标法测定峰面积，计算样品含量，并根据2015 年版《中国药典（四部）》（通则 0941）[14]计算含量均匀度（A ＋2．2 S），结果均符合要求。详见表4。

表4 样品含量均匀度测定结果(n＝10)

3 讨论

3．1 色谱条件考察

波长选择：根据4种成分的紫外光谱图（200～400 nm）进行分析[15]。马来酸氯苯那敏在215 nm波长处的吸收度约为其特征波长261 nm处的3倍，氨基比林和咖啡因的吸收度和其特征波长相近，对乙酰氨基酚的吸收度最小，而对乙酰氨基酚的处方量最大，马来酸氯苯那敏的处方量最小。综合考虑，选择215 nm波长较合适。

流动相选择：试验中比较了流动相B分别为0．02 moL ／L 磷酸二氢钾溶液或 0．02 moL ／L 磷酸二氢钾溶液 －三乙胺（100∶0．02）对色谱峰的影响。结果显示，无三乙胺时氨基比林峰的对称性差，选用后者为流动相。同时比较了梯度洗脱与等度洗脱对分离效能的影响。4种组分（5个峰）理化性质不一致，当采用甲醇－0．02 mol／L 磷酸二氢钾溶液 － 三乙胺（20 ∶80）为流动相等度洗脱时，氯苯那敏不出峰，氨基比林出峰时间约为19 min，且峰展宽，采用梯度洗脱提高甲醇比例，有利于氯苯那敏和氨基比林峰的分离。经过考察，在此梯度洗脱程序下，4组分（5个峰）在13 min内全部洗脱出来，各峰间分离度好，氨基比林峰窄而尖。

3．2 样品溶剂选择

本研究中比较了95%乙醇、无水乙醇、25%甲醇、25%甲醇（分别用 10% 磷酸调 pH 至 3．5，2．5，1．5）6 种溶剂对各组分提取效果的影响。结果采用95%乙醇和无水乙醇提取的样品溶液色谱图中对乙酰氨基酚峰和咖啡因峰有肩峰，且峰展宽；采用25%甲醇（用10%磷酸调pH至2．5和1．5）提取的样品溶液色谱图中氨基比林峰形差，峰展宽，拖尾；25%甲醇对氯苯那敏的提取率低。经过考察，最后选用25%甲醇（用10%磷酸调pH至 3．5）为溶剂。

3．3 应用价值

现行法定标准采用HPLC等度洗脱法分2次测定酚氨咖敏片中4组分的含量。本研究方法优势在于：一是采用HPLC法同时测定了酚氨咖敏片4组分含量，考察了咖啡因和马来酸氯苯那敏的含量均匀度，操作简便，氯苯那敏出峰时间约缩短一半；二是色谱图中，对乙酰氨基酚峰和咖啡因峰分离度升高2倍多，分离效能大幅提高；三是检测波长处马来酸氯苯那敏紫外吸收强度提高了3倍，检测灵敏度明显升高。可见，本方法简便、快速、准确，适用于酚氨咖敏片的质量评价。

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