高效液相色谱法同时测定解郁安神颗粒中甘草苷及甘草酸含量*

樊宝娟，黄 艳，罗定强，吴 芳，杨亚丽，戴 涌

（陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

解郁安神颗粒由甘草、柴胡、大枣、石菖蒲、半夏、白术、浮小麦、远志、栀子、百合、胆南星、郁金、龙齿、酸枣仁、茯苓、当归16味中药材经提取加工而成，有疏肝解郁、安神定志功效，用于情志不畅、肝郁气滞所致失眠、心烦、焦虑、健忘，神经官能症、更年期综合征见上述证候者。方中甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药功效[1]。甘草的主要成分为三萜类与黄酮类成分，甘草苷及甘草酸则是这两类化合物中重要的单体活性成分[2－3]。甘草酸有抗炎、抗病毒等作用，甘草苷有抗抑郁、神经保护、肝脏毒性保护等作用[4－7]。为有效控制该药品的质量及确保药效，节约检验成本，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法在同一色谱系统中测定解郁安神颗粒中甘草酸及甘草苷的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC－20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartorius BS224S型电子天平，AE－240型电子分析天平（赛多利斯公司）；KQ－500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴箱（北京化玻联医疗器械有限公司）。

1．2 试药

甘草酸对照品（批号为 110731－201418）、甘草苷对照品（批号为111610－201106）均购自中国食品药品检定研究院；192批解郁安神颗粒样品均为2016国家评价性抽验抽样所得，分别为14个生产企业的不同批次；甘草阴性对照及解郁安神颗粒自提样品为陕西省食品药品检验所中药室采用自购药材按处方工艺提取所得；乙腈（美国天地公司）为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XD－C18柱（250mm×4．6mm，5 μm）；流动相[8－10]：乙腈（A） －0．05% 磷酸溶液（B），梯度洗脱（见表1）；检测波长：237 nm；流速：1．0 mL ／min；柱温：35℃。

表1 流动相梯度洗脱表

2．2 溶液制备

供试品溶液[11－15]：取样品适量，研细，称取 1 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液：取甘草苷对照品、甘草酸对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每1 mL含甘草苷15 μg及甘草酸25 μg的溶液，即得。

阴性对照品溶液：取按处方和工艺制备的不含甘草的阴性样品1 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性考察：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，进样，记录色谱图。阴性对照品溶液色谱中，在与甘草苷、甘草酸对照品保留时间处无色谱峰，说明阴性对照无干扰，色谱图见图1。

线性关系考察：精密吸取质量浓度为13．68 μg／mL的甘草苷及质量浓度为23．48 μg／mL的甘草酸对照品溶液 1，2，5，10，15，25 μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归。结果甘草苷回归方程为 Y＝1 831．1 X＋20901，r＝0．9992(n＝6)，线性范围为 13．68～342．00μg；甘草酸回归方程为 Y＝290．0 X＋2 386．0，r＝0．996 8(n ＝6)，线性范围为 23．48 ～ 587．00 μg。

精密度试验：精密吸取甘草苷质量浓度为13．68μg／mL及甘草酸质量浓度为 23．48 μg／mL的混合对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，按拟订色谱条件测定峰面积。结果甘草苷、甘草酸峰面积的 RSD分别为0．36%和 1．18% （n＝ 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：分别于 0，5，10，15，20，25 h 时对供试品溶液进行测定。结果甘草苷、甘草酸峰面积的 RSD分别为 1．19% ，0．90%（n ＝6）。表明甘草苷及甘草酸在供试品溶液中25 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品混合均匀，按上述方法制备6份供试品溶液，分别依法进样测定。结果甘草苷、甘草酸含量的 RSD分别为 1．16%和 1．01%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别精密量取已知含量的样品（甘草酸含量为 1．00 mg ／g，甘草苷含量为 0．12 mg ／g）6 份，各 0．5 g，分别加入质量浓度为 0．521 g／L的甘草酸对照品溶液1 mL及质量浓度为0．034 g／L的甘草苷对照品溶液1 mL，同法制备供试品溶液，测定。结果见表2。

图1 专属性考察高效液相色谱图

2．4 样品含量测定

采用拟订方法测定样品，结果表明，不同批次、不同企业间的各个组分含量差异明显。样品总批次为192批，不合格 148批，不合格率为 77．08%，详见表3。可见，8家企业不合格率大于95．00%，其余企业也均存在不同程度的不合格现象。提示企业在甘草投料中应制订定量指标，加大把关力度，确保投料的准确性。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

表3 样品判定结果统计表

3 讨论

根据解郁安神颗粒的处方量及工艺，解郁安神颗粒中每袋理论含有甘草0．3 g，参照2015年版《中国药典（一部）》甘草项下甘草酸及甘草苷含量规定，考虑水提取工艺，暂定样品每袋含甘草苷（C21H22O9）不得少于0．45 mg，甘草酸（C42H62O16）不得少于 1．80 mg。

本研究中分别考察了甲醇、乙醇、70%甲醇为提取溶剂，结果以70%甲醇为溶剂时，提取最完全。另对检测波长、柱温、流动相等条件均进行了探索，结果显示，流动相为乙腈 －0．05% 磷酸溶液梯度洗脱，峰形和分离效果最佳，在237 nm波长处目标物响应值最大，且无干扰，柱温在30，35，40℃时无明显差异，故暂定柱温为35℃。

综上所述，采用本研究中新建立的方法，可快速测定解郁安神颗粒中甘草苷及甘草酸的含量，该方法精确度、效率及成本控制等方面也均有优势，为更好地控制该制剂质量奠定了基础，也可为控制甘草药材的治疗量提供参考。

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