高效液相色谱法测定妇炎灵洗剂中连翘苷含量*

陈 路 ，翟炎妹 ，闫炳雄 ，吴无畏 ，宋志军 ，缪剑华 △

（1．广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023； 2．桂林医学院，广西 桂林 541004）

现代临床医学认为，对于妇科炎症的治疗，应多应用抗生素。但各类抗生素应用存在极大局限性，且耐药菌株逐年增多，出现不良反应的概率越来越大，已无法满足人们的需求[1－2]。目前，中药治疗妇科病不仅能取得较好的疗效，且无明显不良反应，安全性极高[3]。通过近10年的应用发展，中成药洗液已成为医院重要的妇科炎症外用制剂[4]。妇炎灵洗剂是20世纪90年代，广西妇幼保健院在收集壮族民间验方和整理临床用药经验的基础上创制出来的中药外用洗剂，由山银花、连翘、黄芩、黄柏、白花蛇舌草、大血藤、三棱、莪术、丹参、赤芍等药材经科学组方，具有清热解毒、通络活血之功效，主要用于盆腔炎、附件炎、子宫颈炎，霉菌，滴虫、真菌性阴道炎、外阴瘙痒，以及男女溃疡性化脓性生殖器炎症等。目前，该制剂已在临床应用23 120多例，对妇科疾病的防治工作起到了巨大作用，但目前该洗剂尚未建立质量控制标准。为此，笔者建立了测定连翘苷含量的高效液相色谱（HPLC）法，现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Varian 210型高效液相色谱仪（美国瓦里安公司）；CP224S型十万分之一天平（Sartorius公司）；UV－1240型紫外可见光光度计（Shimadzu公司）。

1．2 试药

连翘苷对照品（批号为110821－201615，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)；妇炎灵洗剂(广西妇幼保健院自制)；甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20160719）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 水（21 ∶79）；检测波长：277 nm；流速：1．0 mL ／min；柱温：30 ℃ ；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

对照品溶液：称取连翘苷94．40 mg，精密称定，置200 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（质量浓度为 0．472 0 g／L）；再精密量取以上对照品贮备液5 mL置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液（质量浓度为 0．236 0 g／L），微孔滤膜滤过，即得。

供试品溶液：精密量取妇炎灵洗液10 mL，水浴蒸干，加50%甲醇溶解，置25 mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：精密量取不含连翘的阴性样品10 mL，蒸干，加50%甲醇溶解，置25 mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2．3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2．2项下3种溶液各10 mL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，连翘苷色谱峰分离效果良好，且阴性对照品溶液在相同保留时间处未见干扰，系统适用性良好，专属性强，详见图1。

线性关系考察：分别精密量取连翘苷对照品贮备液（0．472 0 g ／L）1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL，置 10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，依法测定。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程 Y＝10．088 X －0．909 9，R2＝ 0．999 7(n ＝10)。结果表明，连翘苷进样量在 0．472 0 ～ 4．720 0 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：吸取同一连翘苷对照品溶液（0．2360g／L），连续重复进样6次，依法测定，记录峰面积。结果的RSD为0．75%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批样品（批号为170201），依法制备供试品溶液，分别于 0，1，2，4，8，12 h 时注入液相色谱仪，依法测定，记录峰面积。结果的 RSD为1．66%(n＝6)，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：精密量取妇炎灵洗剂样品（批号为170201）10 mL，共 6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果连翘苷的平均含量为 0．586 8 g／L，RSD为1．44%(n＝6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知连翘苷含量的样品5 mL（含连翘苷 0．586 8 g／L），分别精密加入上述对照品贮备液3，6，9 mL，低、中、高质量浓度各3份，制备测定，计算回收率。结果见表1。

图1 妇炎灵洗剂高效液相色谱图

2．4 样品含量测定

分别取不同批号的妇炎灵洗剂10批，依法制备供试品溶液，并进样测定，计算连翘苷含量。结果批号为170201， 170202， 170203， 170204， 170206， 170223，170226，170228，170301，170302 的样品中连翘苷含量分别为 0．586 8，0．426 9，0．361 0，0．339 0，0．354 2，0．357 7，0．428 3，0．376 6，0．426 9，0．426 9 g ／L。

表1 妇炎灵洗液的加样回收试验结果（n＝9）

3 讨论

3．1 质量评价指标选择

[5－8]，对妇炎灵洗剂中6味中药（山银花、连翘、黄芩、黄柏、丹参、赤芍）进行分析，以建立最佳质量评价指标。处方中的山银花、黄芩、黄柏、丹参、赤芍中的主要成分为绿原酸、黄芩苷、小檗碱、丹参酮ⅡA、芍药苷，在分析时有阴性干扰，且不易排除，故暂不作为本处方的质量评价指标。连翘中连翘苷因无阴性干扰，同时在处方中为君药，能清热解毒，既善解在里之热毒，又能散气血凝聚、去脓腐，并能疏风止痒[9－10]。现代研究表明，连翘苷具有明显的抗菌、抗炎和解热作用，且化学性质稳定[11－13]。因此，以连翘苷作为妇炎灵洗剂的质量评价指标。

3．2 样品处理方法选择

样品的制备方法，摸索了80%醇沉蒸干后甲醇溶解，乙酸乙酯萃蒸干后甲醇溶解[14]，过固相萃取柱蒸干后甲醇溶解，过中性氧化铝柱蒸干后甲醇溶解，直接甲醇溶解，80%醇沉蒸干后50%甲醇溶解，用固相萃取柱过滤蒸干后50%甲醇溶解，过中性氧化铝柱蒸干后50%甲醇溶解[15]，蒸干后50%甲醇溶解等处理方法。研究结果表明，以蒸干后50%甲醇制备的样品，溶解度大，既易行又无阴性干扰。

3．3 流动相选择

参考文献[16]，曾选用乙腈－水（25∶78）作流动相，结果连翘苷与样品中其他峰的分离度小且峰形不好，还采用不同比例的乙腈－水系统，比较样品的出峰时间、理论板数、分离度和峰形（对称性），故最终选择了本方法的流动相比例[乙腈－水（21∶79)]，其保留时间虽长，但分离度高，柱效高，理论板数按连翘苷计算应不低于10 000。采用本方法的流动相测定妇炎灵洗剂中连翘苷的含量，回收率高，线性关系良好，且测定条件易于操作。

3．4 色谱柱选择

曾采用 Kromasil 100－5 C18柱（150 mm ×4．6 mm，5 μm），Diamomsil C18柱 （250 mm × 4．6 mm，5 μm），Agilent XDB C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）测定样品溶液。以Kromasil为色谱柱测得样品溶液的分离度虽较好，但保留时间较长，因而不被采用；而Diamomsil色谱柱测得样品溶液的峰形差，而不作选择；Agilent XDB C18色谱柱测得样品溶液中的连翘苷的保留时间虽长，但与前后杂质峰的分离度均大于1．5，且峰形和分离度均良好，符合《中国药典》规定。

3．5 检测波长的选择

称取连翘苷对照品 0．22 mg，精密称定，置 10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，稀释5倍后，在190～600 nm波长处测定吸光度。结果连翘苷在277 nm波长处有一平滑、明显的吸收峰，故选择277 nm为测定波长。

参考文献：

[1]刘克玲，张德英，王临虹，等．中国部分城市已婚妇女妇科常见病流行病学调查[J]．中国妇幼保健，2001，16（5）：298 －300．

[2]韦秋华．广西区4738例妇女病普查结果分析[J]．卫生软科学，2008，22（6）：502 － 503．

[3]张丽伟．妇科消炎片治疗妇科炎症的疗效观察[J]．临床医药文献杂志，2015，2（21）：4381 － 4382．

[4]颜 芬，陈 静．妇科外用药门诊住院使用情况分析[J]．安徽医药，2005，9（9）：703．

[5]黄鸣清，谢友良，王德杭，等．HPLC同时测定妇炎康片中芍药苷、丹酚酸 B、小檗碱[J]．中国实验方剂学杂志，2011，22（17）：68 －71．

[6]潘 勇，刘丰贤，邹 辉．HPLC法测定中风通络丸中丹参酮ⅡA和丹酚酸 B的含量[J]．湖南师范大学学报，2014，11（2）：91－93．

[7]景巧敏，杨 墨．HPLC测定复方黄柏液中连翘苷的含量[J]．食品与药品，2009，11（11）：37 －39．

[8]李锦炎，吴洪文．HPLC同时测定山银花中绿原酸和木犀草苷的含量[J]．北方药学，2013，10（8）：10 －11．

[9]邹琼宇，邓文龙，蒋舜媛，等．连翘果实中的化学成分研究[J]．中国中药杂志，2012，37（1）：57 － 60．

[10]吴艳芳，王新胜，袁永亮，等．连翘化学成分研究[J]．中草药，2013，44（15）：2052 － 2054．

[11]胡竟一，雷 玲，余 悦．连翘的抗炎解热作用研究[J]．中药药理与临床，2007，23（3）：51．

[12]简永耀，靳龙文．连翘的化学成分及药理研究[J]．淮海医药，2009，27（4）：349 － 350．

[13]史 洋，王小平，白吉庆，等．连翘抗茵、抗病毒的药理作用研究[J]．中国现代中药，2013，15（11）：950 － 952．

[14]姚文冰．HPLC法测定痰热清注射液中黄芩苷和连翘苷的含量[J]．中国药师，2011，14（10）：1479 － 1480．

[15]万 莉，王益平，潘小华．HPLC测定复方银桔糖浆中连翘苷的含量[J]．中成药，2008，30（1）：151 － 152．

[16]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2015：170－171．