结核感染患者外周血中性粒细胞自噬水平的研究

杜金艳，王 燕，张 燕，陈 敏，邓少丽，陈 鸣,唱 凯

(陆军军医大学第三附属医院检验科，重庆 400042)

结核病作为当今世界重要的传染病之一，严重威胁人类健康。据统计，全球约1/3的人感染过结核分枝杆菌(MTB)[1]。然而在众多的感染人群中，绝大多数并不表现出任何临床症状，仅有约10%的感染者会在一生中的某个时间段发展成为结核病[2]。

自噬，是将细胞内功能不全的细胞器和蛋白质运输到溶酶体进行降解的一种方式，同时也在免疫和炎症中起主要作用。当MTB入侵免疫细胞后会诱导抗炎和(或)促炎细胞因子的释放，调节自噬相关蛋白的表达，抑制或诱导细胞自噬对MTB的清除。Beclin1和微管相关蛋白轻链3(MAPLC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因，并且LC3是自噬体膜上的标记蛋白，长期稳定存在直至与溶酶体相结合，常作为自噬体的标记分子。研究发现，嗜中性粒细胞通过产生更高水平的活性氧(ROS)，增加其吞噬体的pH值并引起结核分枝杆菌自噬，进而介导记忆性CD8+T细胞的杀菌活性，表明嗜中性粒细胞在结核感染过程中发挥重要作用[3-4]。目前关于中性粒细胞自噬水平在结核感染中的作用鲜有研究报道，且自噬相关基因Beclin1在中性粒细胞中所诱导的自噬是否参与人体对结核分支杆菌的调控仍不清楚。据此，本研究从自噬这一细胞的自发性防御机制着手，通过分析结核感染患者外周血中中性粒细胞LC3及Beclin1 mRNA的表达情况，深入探究中性粒细胞在结核病的发病机制过程中的作用，为MTB的预防及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 依据肺结核诊断标准(WS288-2008)，选择2016年12月至2017年6月在重庆市公共卫生医疗救治中心和陆军军医大学第三附属医院就诊的初治结核病患者，共24例，健康对照组选择在该区域中无血源关系的同期入院患者，无肺结核症状或体征，实验室及影像学检测均未提示为肺结核者，共16例。排除疾病情况：免疫抑制剂使用者、合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病。

1.2方法

1.2.1标本采集 分别抽取活动性结核组、健康对照组空腹外周血3～5 mL于EDTA抗凝管，3～6 h内检测自噬水平后分离目的细胞提取总RNA。

1.2.2引物的查找与选择 通过查找Beclin1基因数据信息和文献，利用Primer5.0软件设计PCR扩增引物，如表1，采用GAPDH基因作为内参基因。

表1 PCR 引物及扩增片段

1.2.3采用流式细胞术进行自噬水平检测 Flow CellectTM Autophagy LC3 Antibody-based Assay Kit，自噬检测试剂盒购Millipore公司，仪器为BECMAN，按试剂盒和仪器要求进行操作。

1.2.4外周血中性粒细胞提取 细胞分离试剂购自Thermo Fisher Scientific公司，具体操作步骤如下：(1)取紫头管全血1∶1加入1640培养基稀释，混匀备用；(2)依次加入75%Percoll、60%Percoll 各4 mL于15 mL离心管，加入时不能有任何上层液体冲入下层的情况；(3)将混匀的稀释血液加入最上层；(4)450 g离心20～25 min；(5)液体分3层，最上一层与中间层之间细胞多为淋巴细胞。最下层与中层细胞为中心粒[5]；(6)用滴管吸出目的细胞，加入新15 mL离心管，加1640培养基，补充至14 mL；(7)450 g离心10 min，弃上清；(8)用1 000 μL PBS重悬；(9)转移至1.5 mL EP管，1 000 r/min，离心5 min(4 ℃低温高速离心机)，弃上清(瑞氏染色后显微镜计数，观察有无中性粒细胞，拍照保存)；(10)加入1 000 μL PBS，1 000 r/min，离心5 min(4 ℃低温高速离心机)，弃上清，加入400 μL，按1∶3加入1 mL Trizol溶液，反复震荡，做好标记，存放于-80 ℃超低温冰箱，待提取RNA。

1.2.5RNA的提取及质量检测 取出保存样本室温解冻，提取总RNA。在ThermoND-1000上进行OD260/OD280检测，选择RNA在1.8～2.0范围内的样品用于荧光定量PCR反应，剩余的RNA溶液于-80 ℃保存备用。

1.2.6逆转录合成cDNA及荧光定量PCR 试剂盒购自Roche公司，将模板RNA及相应试剂解冻，逆转录PCR仪为ABI，程序为：(1)逆转录延伸：37 ℃，60 min；(2)灭活逆转录酶：85 ℃，5 min。取出产物，迅速置冰浴5 min；2～8 ℃保存1～2 h或在BIO-RAD(CFX-96)上立即进行荧光定量，扩增程序为：95 ℃，10 min；95 ℃(20 s)→60 ℃(20 s)→72 ℃(20 s)→40个循环。

2 结 果

2.1一般临床资料 本次临床标本收集健康对照组样本16例，其中成年男性6例，平均年龄为(42.96±3.52)岁；成年女性10例，平均年龄为(49.40±5.33)岁；活动性结核组样本24例，其中成年男性19例，平均年龄为(42.96±3.52)岁；成年女性5例，平均年龄为(49.40±5.33)岁。活动性结核组与健康对照组相比，年龄差异无统计学意义(P=0.165 5，P>0.05)；活动性结核组男性(79.2%)比例明显高于健康对照组(37.5%)。

2.2自噬水平比较 采用流式细胞术对活动性结核组和健康对照组外周血中性粒细胞和单个核细胞的自噬水平进行检测，分析在单个核细胞、中性粒细胞中LC3的表达情况。活动性结核组单个核细胞自噬水平与健康对照组相比，差异无统计学意义(P=0.784 2，P>0.05)；中性粒细胞自噬水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P=0.013 8，P<0.05)，见图1～6。

图1 健康对照组单个核细胞自噬水平

图2 活动性结核组单个核细胞自噬水平

图3 两组单个核细胞自噬水平比较

图4 健康对照组中性粒细胞自噬水平

2.4中性粒细胞Beclin1 mRNA的表达水平 采用实时荧光定量PCR对活动性结核组和健康对照组外周血中性粒细胞Beclin1 mRNA进行检测。以活动性结核组结果为1，发现活动性结核组中性粒细胞Beclin1 mRNA相对内参基因表达低于健康对照组(如图7)，差异有统计学意义(P<0.001)。

图5 活动性结核组中性粒细胞自噬水平

图6 两组中性粒细胞自噬水平比较

图7 Beclin1 mRNA相对表达情况

3 讨 论

自噬，在维持细胞内稳态以及物质的循环利用上具有重要作用。双层膜结构包被细胞质形成自噬小体，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将内容物进行降解，对细胞内外的细微变化能迅速做出反应，有利于细胞快速适应环境变化[6-7]，按照方式不同可分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬是机体免疫非常重要的环节，它既可以直接杀灭MTB，又可以为抗原提呈启动细胞免疫作准备[8]。中性粒细胞，作为机体主要的免疫细胞之一，MTB感染后，迅速从外周血迁移到感染灶，活化并吞噬MTB，并通过NADPH氧化酶介导产生大量ROS，对吞噬的MTB起到快速有效的杀灭作用，但同时也会促进中性粒细胞自身的坏死，造成MTB的免疫逃逸[9]。

本研究发现，活动性结核组男性比例明显高于健康对照组，差异有统计学意义。在男性中，吸烟、饮酒以及重体力劳动比例高于女性，以上危险因素可能降低机体免疫功能，显著增加男性结核病的发病风险[10-11]。活动性结核组中性粒细胞自噬水平(LC3)及Beclin1基因表达明显低于健康对照组。LC3是目前对自噬具有高度特异性的标志物，参与自噬体隔离膜的形成。MTB感染免疫细胞后，LC3-1型(胞质型)转变为LC3-2型(胞膜型)，通过对其定位可反映细胞的自噬水平。Beclin1基因是第一个被鉴定的自噬基因，是酵母自噬基因ATG6的同源物，是参与自噬调控的重要基因[12]。结核病的发生是由T淋巴细胞介导的细胞免疫反应，体液免疫产生的抗体对其作用局限，故推测活动性结核组自噬水平的降低及Beclin1基因表达的下调与MTB感染及破坏机体免疫系统有关。但也有研究发现，Beclin1蛋白可以激活mTOR蛋白，从而抑制细胞的自噬[13]。

中性粒细胞具有吞噬并杀灭细胞内结核分支杆菌的作用，而且这种杀菌机制与MTB感染同LC3蛋白减少有关，从而推断中性粒细胞也直接参与抗结核分枝杆菌免疫。目前，关于Beclin1基因对中性粒细胞所诱导的自噬与MTB感染调控的研究较少，机制并不清楚，随着对自噬进一步的研究，可深入了解中性粒细胞自噬情况在结核病发生发展的具体过程，为结核病的治疗提供新的靶向治疗方案。

4 结 论

目前关于结核感染患者外周血中性粒细胞自噬水平在结核感染中报道较少，本研究从细胞自发性防御机制着手，分析中性粒细胞中自噬标志性蛋白LC3水平及相关基因Becline 表达，发现结核感染患者外周血中性粒细胞自噬水平LC3降低，且Becline基因表达的下调，可能与结核病的发生发展有密切关系。