动物源性皮肤癣菌病32例患者病原菌体外药敏试验

陈玉娟，熊心猜，张 浩，唐芹芹

动物源性皮肤癣菌病是由皮肤癣菌感染引起的人兽共患疾病，治疗皮肤癣菌病的药物主要为非多烯类、唑类、丙烯胺类等药物，各种菌对药物的敏感性不同。本试验对已收集并经鉴定确诊为动物源性皮肤癣菌病的皮肤癣菌[1]为目标株，参照美国临床实验室标准化研究所（CLSI）M38-A2方案[2]，选择灰黄霉素（GRI）、伊曲康唑（ICZ）、特比萘芬（TBF）、氟康唑（FCZ）为实验药物，对分离的皮肤癣菌进行抗真菌药物敏感性实验，观察其对临床常见抗真菌药物的敏感性，为临床选药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集2013年10月—2014年11月就诊于川北医学院附属医院皮肤科的患者，有明确动物接触史，经鉴定人与动物由同一种皮肤癣菌致病，确诊为动物源性皮肤癣菌病32例患者的菌株。经形态学、生理生化学，并以微卫星序列（GACA）4、NTS1、NTS2为引物行分子生物学方法鉴定，共分离出3种皮肤癣菌，包括21株犬小孢子菌、6株须癣毛癣菌复合体和5株石膏样小孢子菌。

1.1.2 药物 GRI（东京化工业株式会社，批号：QR3KJ-JK，纯度＞97.0%）；ICZ（东京化工业株式会社，批号：IRNNI-CR，纯度＞98.0%）；FCZ（东京化工业株式会社，批号：QAGTF-LQ，纯度＞98.0%）；TBF（美仑生物技术有限公司，批号：S1101A，纯度＞98.5%）。FCZ是水溶性药物，在无菌操作下用灭菌蒸馏水溶解，药物浓度的范围配成0.125 0 ～ 64.000 0 μg/ml；GRI、ICZ、TBF 是 脂 溶性药物，溶于100%的二甲基亚砜（DMSO），药物浓度的范围为 ：GRI与 ICZ 0.031 3 ～ 16.000 0 μg/ml，TBF 0.001 0～0.500 0 μg/ml。且DMSO的最终浓度不能超过1%，以免抑制真菌活性。

1.1.3 主要试剂与仪器 沙堡葡萄糖琼脂培养基（SDA培养基）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）、RPMI 1640（含谷氨酰胺，不含酚红）、DMSO、3-（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）、聚山梨酸20、氢氧化钠（NaOH）。96孔培养板（U型底）、血细胞计数板、放大镜、超净工作台（AIRTECH,JPN），电热恒温培养箱（重庆永恒实验仪器厂）、光学显微镜（Olympus company，JPN）。

1.1.4 质控菌株 须癣毛癣菌复合体 ATCC-4439和红色毛癣菌 ATCC-4438，购自中国医学科学院皮肤病研究所真菌菌种保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 取质控菌株和已纯化的目标菌株，转种于SDA培养基上培养7 d活化真菌。将已活化菌株接种于PDA培养基上，28℃培养7 d。采用M38-A2方案[2]及相关文献[3,4]的方案制备菌悬液，将2 ml含有0.1%聚山梨酸20的0.85%无菌盐水覆盖菌落，用无菌试纸轻刮菌落表面使孢子脱落，反复多次抽吸液体制成菌悬液，将菌悬液移至一次性无菌塑料试管中，置振荡器上振荡5 min，静置10 min。用加样枪吸取1 ml上层均质液体至无菌试管中，调整菌悬液浓度为（2～3）×105CFU/ml，即比浊仪的浊度为0.2～0.3麦氏单位[5]，并用血细胞计数板验证计数。质控菌株采用上述方法制备菌悬液。取部分已制备好的菌悬液20 μl，用灭菌蒸馏水稀释25倍后取100 μl均匀涂布于SDA培养皿上，28℃培养3～5 d后，计数培养皿上菌落的数量，以获取准确的菌悬液浓度。

1.2.2 96孔药敏板的制备及培养 采用M38-A2方案[2]及文献[3,4]推荐的微量液基稀释法制备96孔药敏板（图1）。将4种药物的储备液取出融化后，用RPMI 1640液体培养基将药物浓度稀释成药敏板首孔终浓度的 2 倍，即 GRI 32 μg/ml，ICZ 32 μg/ml，TBF 1 μg/ml，FCZ 128 μg/ml。用 96 孔板进行实验，首先在1～11孔中各加入100 μl RPMI 1640培养基，第12孔加200 μl RPMI 1640培养基；以GRI为例，在首孔内加入32 μg/ml 的工作液100 μl，混匀，此时首孔药物浓度为16 μg/ml，从中吸取100 μl加入第2孔，混匀后第2孔的浓度为8 μg/ml，以此类推稀释至第10孔时，将最后的100 μl液体弃去。第11孔为生长对照（阳性对照），不加药物稀释液，第12孔为空白对照（阴性对照）。在第1～11孔中各加入100 μl菌悬液，此时1～12孔内均含有200 μl的液体。将已接种完成的96孔药敏板放置28℃恒温箱中静置孵育培养，96 h后读取最低抑菌浓度（MIC）值。每次试验均包括质控菌株。

1.2.3 微量稀释法MIC值判读 根据CLSI M38-A2方案的标准，在自然光充足的条件下，借助阅读镜辅助肉眼判读MIC值。将加有GRI、ICZ、TBF、FCZ的孔中菌落生长情况与生长对照相比，肉眼观察出现80%或更多生长抑制作为判读MIC值的标准。为保证结果的准确性，本实验结果均由2人共同判读MIC值。每株标本重复做2次实验。

图1 倍比稀释法制备96孔药敏板制备图

1.2.4 质控 实验过程中尽量排除可能影响实验的因素，比如新配制的RPMI 1640培养基、抗真菌药物的批号更换、新制备的96孔药敏板以及实验器皿的更换等，均应进行质量控制，以确保体外抗真菌药敏试验过程的精确性和准确性，严格监测实验中的温度、湿度及仪器的使用状况，操作时严格按操作要求进行。每次操作过程均设质控菌株。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计，抗真菌药物之间的MIC值进行Kruskal-Wallis秩和检验，不同菌种的两两比较采用S-N-K法。P＜0.01认为差异有统计学意义。

2 结果

经过96 h培养后观察，GRI、ICZ、TBF、FCZ 4 种药物敏感试验的MIC范围见表1，MIC50值及MIC90值见表2。4种抗真菌药物对犬小孢子菌的药敏试验MIC90：GRI为2.000 0 μg/ml，ICZ 为 0.500 0 μg/ml，TBF 为 0.015 6 μg/ml，FCZ 为16.000 0 μg/ml。4种抗真菌药物对须癣毛癣菌复合体的药敏试验 MIC90：GRI为 1.000 0 μg/ml，ICZ 为0.500 0 μg/ml，TBF 为 0.062 5 μg/ml，FCZ 为 32.000 0 μg/ml。4种抗真菌药物对石膏样小孢子菌的药敏试验MIC90：GRI 为 2.000 0 μg/ml，ICZ 为 1.000 0 μg/ml，TBF 为 0.062 5 μg/ml，FCZ 为 16.000 0 μg/ml。

4种不同抗真菌药物对犬小孢子菌、须癣毛癣菌复合体和石膏样小孢子菌的MIC值经Kruskal-Wallis秩和检验（P＜0.01），差异有统计学意义（表3）。采用S-N-K法对不同菌种两两比较可知，4种药物对犬小孢子菌和须癣毛癣菌复合体的药敏试验 MIC 值平均秩次为：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ，4种药物对石膏样小孢子菌的药敏试验MIC值平均秩次为 ：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以 3 种皮肤癣菌为总体进行Kruskal-Wallis秩和检验和S-N-K法检验，4种药物对皮肤癣菌的MIC值差异有统计学意义（P＜0.01），其药敏试验MIC值的平均秩次为：TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。

3 讨论

2008年美国CLSI在产孢丝状真菌M38-A药敏试验方案的基础上提出了M38-A2方案[2]，试验方法的标准化使皮肤癣菌抗真菌药敏试验结果可靠。

表1 皮肤癣菌的MIC值 （μg/ml）

表2 皮肤癣菌的MIC50值及MIC90值 （μg/ml）

菌 株 GRI ICZ TBF FCZ P值M. canis 51.79 33.93 11.10 73.19 0.000 T. mentagrophytes 14.17 10.33 4.00 21.50 0.000 N. gypsea 10.40 10.30 3.60 17.70 0.002 Tot 75.28 54.13 17.27 111.39 0.000

GRI在1958年开始用于临床，应用时间长，是20世纪末治疗头癣的主要用药。随着科学的发展，ICZ和TBF已成为目前治疗皮肤癣菌病最常用的口服抗真菌药。本实验对GRI、ICZ、TBF和FCZ 4种药物的MIC值比较显示，4种不同抗真菌药物对犬小孢子菌、须癣毛癣菌复合体和石膏样小孢子菌的MIC值差异有统计学意义。4种药物对犬小孢子菌和须癣毛癣菌复合体的抗真菌效果依次为TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ；4种药物对石膏样小孢子菌的抗真菌效果依次为：TBF＜ICZ/GRI＜FCZ。以3种皮肤癣菌为总体分析可见，4种药物对皮肤癣菌的抗真菌效果依次为 TBF＜ICZ＜GRI＜FCZ。以特比萘芬的抗真菌效果最好，MIC90为0.0625 μg/ml，MIC值范围为 0.001 0 ～ 0.062 5 μg/ml，其次为 ICZ 和 GRI，FCZ的抗真菌效果较差，与Silvat等[6]和Ansari 等[7]报道的结果基本相同。实验证明，早期正确的抗真菌治疗直接影响患者的预后[8]，该结果可对本地区皮肤癣菌病患者的临床治疗提供选药参考。

本实验结果与Ansari等[7]进行的一项研究结果不完全一致，可能是由于菌种的地区差异，对抗真菌药物的敏感性不同，或实验室间方法及操作差异的结果。本试验缺乏皮肤癣菌抗真菌药物的体内试验及对MIC值与临床患者治疗效果之间的相关性分析，有待进一步研究。

Gupta等[9]提出了关于现有药物的新配方及药物创新的见解。Lopes等[10]介绍了各种植物衍生物及其活性成分抗皮肤癣菌的作用机制。国内研究发现，生物碱类、酚类、黄酮类中药单体具有抗真菌活性，且与目前临床应用的抗真菌药物有协同作用[11]。人口的流动、人类生活方式的改变及抗真菌药物的应用不断推动着皮肤癣菌的进化[12]，是否可以找到尚未开发的化学成分的新药是目前面临的问题。