再生胰岛衍生家族成员4在不同分子分型乳腺癌中的表达及其与预后的关系

宋姗姗，聂艳红，王红霞，王永芳，陈 昊

0 引 言

2013年St Gallen乳腺癌会议国际共识，将乳腺癌分为Luminal A型（LA）、Luminal B型（LB）、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）［1］。在分子分型的基础上对乳腺癌患者采取个性化治疗，可有效降低患者的病死率。但目前TNBC仍缺乏化疗之外其他有效治疗手段，具有预后差、转移率高、总生存率低等特点［2］，关于TNBC的研究仍是目前热点之一。再生胰岛衍生家族成员4（regenerating islet-derived family，member 4，RegIV）主要在近端胃肠道表达，诱导细胞的生长、增殖、侵袭、转移、抗凋亡和耐药，参与肿瘤的发生发展［3］。在结直肠癌的研究中发现Reg IV与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）呈正相关［4］，推测Reg IV是EGFR/Akt/AP-1通路的上游因子［5-6］。鉴于TNBC中亦有EGFR相关信号通路的发生［7］，EGFR在TNBC中的阳性表达率较高［8］，推测Reg IV在TNBC中可能发挥作用。本研究检测Reg IV在乳腺癌不同分子分型中的表达情况，并分析其与EGFR、临床病理特征、生存预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2011年3月至2017年10月连云港市第一人民医院病理科存档的284例乳腺癌患者的病理资料。纳入标准：所有患者均为浸润性乳腺癌；排除标准：术前进行放化疗。乳腺癌分子分型采用免疫组织化学替代分型：LA、LB、HER-2+和TNBC型［1］。LA型（n=71）：ER阳性，PR表达≥20%，HER-2阴性且Ki-67＜20%者。LB型（n=84）分为2种亚型：①HER-2阴性亚型为ER阳性、HER-2阴性、Ki-67≥20%或PR＜20%者；②HER-2阳性亚型为ER阳性、HER-2阳性、PR及Ki-67任何表达者。HER-2过表达型（n=69）：ER和PR阴性、HER-2阳性者。TNBC型（n=60）：ER、PR及HER-2均为阴性者。

1.2 免疫组织化学及结果判读手术标本经3.7%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，采用免疫组织化学EnVision二步法对石蜡切片进行染色，光镜观察。一抗Reg IV购自Proteintech公司，ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR均购自广州安必平公司。用结肠癌阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，其评分标准：Reg IV阳性表达主要位于细胞膜和（或）细胞质，根据染色强度与阳性细胞百分比乘积得分进行综合计分。①随机选取5～10个高倍镜视野（*400）计数阳性细胞百分比的平均数，按照阳性细胞数计分：无阳性细胞为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；②按照着色强弱计分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；③阳性细胞百分比的得分乘以染色强度的得分：≤3分为阴性，＞3分为阳性。结果均由2位正高级职称病理医师双盲评估。ER、PR的结果判读依据2012年美国临床肿瘤学会（ASCO）的标准。HER-2的判读依据2013年ASCO/CAP乳腺癌HER-2检测指南，将细胞膜染色（3+）定义为HER-2阳性，（0）及（1+）定义为HER-2阴性；对于EGFR存在肯定的胞膜染色即视为阳性；Ki-67＜20%为低表达，≥20%为高表达。

1.3 荧光原位杂交对HER-2免疫组化（++）者，再次进行FISH检测。采用HER-2/neu基因检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），检测乳腺癌细胞中HER-2/neu基因的扩增情况，基因扩增者为HER-2阳性，无扩增者为HER-2阴性。

1.4 生物学数据库分析Kaplan-Meier Plotter公共数据库收录了54675个基因和10461个癌症样本信息，其中包含5143例乳腺癌患者生存资料和基因表达信息。分析数据库内Reg IVmRNA在乳腺癌中的表达水平与患者预后的关系（http：//kmplot.com/analysis）。

1.5 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行分析。计数资料采用频数（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson进行相关性分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Reg IV在不同分子分型乳腺癌中的表达情况Reg IV在LA、LB、HER-2过表达型及TNBC型中的阳性率分别为52.11%（37/71）、50.00%（42/84）、65.22%（45/69）及20.00%（12/60），组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。HER-2阳性亚型的Reg IV阳性率高于HER-2阴性亚型（60.00%vs38.46%），差异有统计学意义（P＜0.05）。乳腺癌细胞中Reg IV的染色主要定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性染色呈棕黄色。见图1。

图1 乳腺癌组织中的Reg IV蛋白免疫组化染色（EnVision ×200）Figure 1 Immunohistochemical staining of the Reg IV protein in breast cancer tissue（EnVision ×200）

2.2 Reg IV与乳腺癌分型相关标志物的关系Reg IV在PR、HER-2阳性中表达较阴性明显增高（P＜0.01），见表1。Reg IV与PR、HER-2的Pearson相关系数r分别为0.192、0.243（P＜0.01）。

表1 浸润性乳腺癌患者Reg IV与乳腺癌分型相关标志物的关系Table 1 Correlation between the expression of Reg IV and related markers in breast cancer

2.3 Reg IV与临床病理特征的关系Reg IV与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期相关（P＜0.05）。Reg IV阳性者肿瘤直径更小，淋巴结转移率低，TNM分期低。见表2。

表2 浸润性乳腺癌患者Reg IV与临床病理特征之间的关系（n）Table 2 Correlation of clinicopathological features in 284 breast cancer patients and Reg IV expression level（n）

2.4 Reg IV与乳腺癌患者生存预后的关系Kaplan-Meier Plotter数据库中，Reg IV对应的AffyID分别为1554436_a_at和223447_at。生存分析结果示：Reg IV高表达的乳腺癌患者复发风险明显低于低表达者（HR=0.59，95%CI：0.50～0.69），进一步分析发现Reg IV高表达的LA乳腺癌患者复发风险明显低于低表达者（HR=0.63，95%CI：0.48～0.82），Reg IV高表达的LB乳腺癌患者复发风险明显低于低表达者（HR=0.56，95%CI：0.40～0.76），Reg IV 高表达的 TNBC 乳腺癌患者复发风险明显低于低表达者（HR=0.51，95%CI：0.36～0.71）。见图 2。

图2 浸润性乳腺癌患者Reg IV表达与RFS之间的关系Figure 2 Relationship between Reg IV expression level and RFS in breast cancer patients

3 讨 论

乳腺癌分子分型的个性化治疗已在临床广泛应用，但TNBC型乳腺癌由于其独特的分子表型决定了对常规化疗及靶向治疗均不敏感，是目前唯一未建立特异性靶向治疗的亚型。因此寻找特异性治疗靶点是目前TNBC型乳腺癌研究中的热点之一。Reg IV是从炎症性肠病基因库中筛选出的一个新型基因，可参与多种恶性肿瘤的发生，但目前的研究主要集中在消化系统，如胃癌、结直肠癌、胰腺癌及胆囊癌等［10-12］，在乳腺癌中尚罕见报道。

本研究结果显示，Reg IV在乳腺癌中的阳性表达率为47.89%，该结果与Oue等［13］和Sentani等［14］结果不符，可能是由于文献中的组织学类型不同（研究对象仅为少量乳腺印戒细胞癌的患者），或样本数量较少导致。本研究亦发现Reg IV在HER-2阳性者中表达最高，且LB型的HER-2阳性亚型的阳性率高于HER-2阴性亚型（P＜0.05），Reg IV与HER-2表达呈正相关。HER-2是一种原癌基因，在美国国立综合癌症网络指南中已明确其扩增与乳腺癌的预后和靶向治疗显著相关，因此推测Reg IV有望成为HER-2+乳腺癌的潜在靶点。

有研究认为EGFR信号通路的异常与TNBC的发生发展密切相关［7］，Numata等［5］和Wang等［6］研究亦发现Reg IV与EGFR的信号通路有关，并促使肿瘤的发生发展。本研究显示Reg IV与EGFR无相关性，且在TNBC中表达最低，推测Reg IV在TNBC中可能不起主要作用。研究发现在结直肠癌中Reg IV表达与EGFR相关［4］，与本研究差异可能源于组织特异性、肿瘤异质性、实验误差等，仍需大量的研究来证实。ER、PR状态是乳腺癌常规治疗的重要参考指标，在临床上单独PR状态并不常规用于指导治疗决策，但PR在乳腺癌中的作用始终存在争议［15-16］。PR是ER依赖型基因产物，PR的表达受ER调控。而本研究显示Reg IV仅与PR相关、而与ER不相关。有学者研究发现存在ER-/PR+的乳腺癌类型［17］，表明PR并非一直与ER同步表达。

另有研究发现PR+乳腺癌患者生存率高，是乳腺癌预后良好的指标［18］。本研究Reg IV与PR呈正相关；预后最差的TNBC型中Reg IV表达最低；Reg IV阳性患者肿瘤直径更小、淋巴结转移率及临床分期更低，提示Reg IV有可能是评估乳腺癌患者预后良好的指标之一。通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析，Reg IV高表达患者RFS更好，进一步从分子分型角度分析发现在LA、LB和TNBC型乳腺癌中Reg IV高表达患者预后更佳。上述研究结果均支持Reg IV有可能与预后良好相关。

综上，本研究发现Reg IV在非TNBC型乳腺癌中表达较高（HER-2过表达型＞LA型＞LB型），与PR及HER-2表达呈正相关，有望在非TNBC的诊断、治疗中发挥潜在作用；Reg IV的表达与EGFR不相关，在TNBC的发生发展中可能不起主要作用；Reg IV在浸润性乳腺癌中的表达与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、生存预后密切相关，可用于评估患者预后。