M蛋白有效抗肿瘤片段的筛选

魏继芳，白静，杜浩，杨俊峰，陈浩，杜娟

（延安大学医学院，陕西 延安 716000）

0 引言

M蛋白是全长由229个氨基酸残基构成的VSV基质蛋白。在抗肿瘤过程中，M蛋白不仅可以通过RaeI/Nup98抑制细胞mRNA从细胞核向细胞质的转运，改变剪切因子hnRNP H在细胞中的定位，还可以通过激活Caspase直接诱导细胞凋亡[1-2]。目前，有报道称野生型M蛋白的编码产物有三种[3]：M1，即全长M蛋白；M2，即仅含全长M蛋白第32位到299位氨基酸残基的片段；M3，即含全长M蛋白第51位到299位氨基酸残基的段片段M蛋白。这三种M蛋白在细胞内定位虽然存在差异但都保留了诱导肿瘤细胞发生凋亡功能。三种野生型M蛋白在诱导肿瘤细胞凋亡中的作用提示：M蛋白可能仅通过其部分结构域发挥抗肿瘤作用。而有关M蛋白结构域功能的报道：M蛋白通过其LDX模体（aa 123-125）参与VSV病毒-宿主间的相互作用和VSV病毒的复制过程，通过其Late-domain 模体（包括PPPY结构域（aa 24-27）和PSAP结构域（aa 37-40））参与细胞毒性和VSV病毒的出芽，Late-domain模体缺失的M蛋白不能使VSV病毒分子脱离宿主细胞膜而释放[3,4]，则证实了以上推测。因此，本文从M蛋白结构出发，利用基因体外操作技术剔除M蛋白的非抗肿瘤序列，找出M蛋白的关键抗肿瘤结构域，为可用于肿瘤治疗的M蛋白瘦身。

1 实验方法

1.1 重组质粒的构建。以pVAX1-MP（M蛋白真核表达载体）为模板，扩增包含M蛋白不同区域的片段，与真核表达载体pEGFP-C1连接，构建成不同片段M蛋白的融合表达质粒pEGFP-C1-M1（即全长M蛋白，含有299个氨基酸残基），pEGFP-C1-M2（含M蛋白第32-299位的氨基酸残基），pEGFP-C1-M3（含M蛋白第51-299位的氨基酸残基），pEGFP-C1-M 4(含M蛋白第75-299位的氨基酸残基），pEGFP-C1-M5（含M蛋白第120-299位的氨基酸残基）和pEGFP-C1-M6（含M蛋白第200-299位的氨基酸残基）。送于基因检测公司进行DNA测序，测序正确的质粒用于后续实验。

1.2 质粒的提取与细胞培养。将测序正确的重组载体经转化、扩增后进行去内毒素大提。离心去除杂质后用于真核细胞转染。将人胃癌SGC-7901细胞培养与含10%胎牛血清的1640培养基中，观察细胞形态，用脂质体转染法将各表达载体转染入细胞，荧光显微镜下观察转染效率。

1.3 细胞增殖检测。脂质体转染法将各重组质粒转染入细胞，按说明书用CCK-8细胞增殖检测试剂盒对细胞增殖情况进行检测。

1.4 实验数据的收集。拍摄细胞图片，收集质粒电泳图和处理细胞增殖检测数据。

2 实验结果

2.1 图1为测序正确的重组质粒与对照质粒电泳图。

从左向右，各泳道分别为DNA Marker，pEGFPC1-M6，pEGFP-C1-M5，pEGFP-C1-M4，pEGFP-C1-M3，pEGFP-C1-M2，pEGFP-C1-M1，pEGFP-C1。

2.2 结果如图2所示。

图2 M蛋白不同区域表达载体在细胞内的表达，从左至右：上排pEGFP-C1，中排：pEGFP-C1-M1，pEGFPC1-M2，pEGFP-C1-M3；下排：pEGFP-C1-M4，pEGFP-C1-M5，pEGFP-C1-M6

2.3 如图3所示。

图3 CCK-8检测不同M蛋白片段对SGC-7901细胞增殖的影响

3 讨论

本研究构建了不同M蛋白截短体的真核表达载体；并用CCK-8检测测定了不同M蛋白截短体的抗肿瘤活性，但还有很多不足。首先，研究仅在胃癌细胞的一个细胞株中对M蛋白及其不同片段的抗肿瘤活性进行了探究，未在其它胃癌细胞、其它组织来源细胞和实验动物体内进行实验，为此，研究结果的适用范围较为局限。其次，研究未对M蛋白及其有效抗肿瘤片段的作用机制进行探究，M蛋白及其有效抗肿瘤片段的作用机制还不清楚[5-7]。

研究通过体外实验在肿瘤细胞中对M蛋白的有效抗肿瘤片段进行来筛选，然而其体内抗肿瘤作用的效果和具体抗肿瘤作用的机制还不清楚。为此，研究后期将会通过动物模型进一步探究M蛋白的抗肿瘤作用，另外，研究也会进一步对M蛋白有效作用片段的抗肿瘤作用机制进行进一步的探讨[8-10]。