COPD急性加重期细菌感染对Th17/Treg平衡及炎性因子水平的影响

侯英宇，刘晨阳，张丹梅，杨敏

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由气道阻塞和肺实质被破坏而引起的以进行性气道炎性反应和不可逆气流受限为主要特征的肺部疾病[1-2]。COPD的急性加重(acute exacerbation of COPD，AECOPD)会导致患者出现呼吸困难、咳嗽和咯痰等临床症状，降低患者的呼吸功能，对疾病进展和预后产生不良影响，同时，其发作频率和严重程度加重与COPD患者的病死率增加有关[3-5]。预计到2021年，AECOPD将成为全球第三大死因[6]。感染、常年接触烟雾和空气污染是导致AECOPD发生的主要原因，其中细菌感染的因素高达70%[7]。研究表明，AECOPD患者免疫功能障碍与免疫抑制细胞数量或功能的改变及效应T细胞的功能障碍有关，机体固有免疫及适应性免疫的抑制导致抗病原机制功能障碍，使AECOPD患者肺部微环境发生持续性的炎性反应并增加疾病的严重程度[8]。辅助性CD4+T细胞(包括Th1、Th17)细胞和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是近年来受到广泛研究的免疫细胞，其平衡失调是导致机体发生持续性炎性反应和免疫抑制的重要原因，同时伴随多种炎性因子水平的变化[9-10]。本研究通过对AECOPD患者外周血Th17/Treg及炎性因子水平改变进行研究，旨在为该病的免疫功能障碍研究及免疫靶向治疗药物开发提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017年6月—2019年6月武警黑龙江总队医院内科确诊为下呼吸道细菌感染的COPD患者118例作为研究对象。纳入标准：(1)COPD的诊断标准参考《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》[11]中的规定，相关病原菌的诊断参考《医院感染诊断标准(试行)》[12]中的规定；(2)临床资料完整，数据完整。排除标准：(1)合并肺结核、病毒性肝炎患者；(2)患有高血压、心脏病及其他严重器官病变者；(3)合并恶性肿瘤患者。根据其肺功能及临床症状分为2组：加重期组(n=62)，临床症状表现为呼气迅速加重，咯痰量增加，痰中带脓；其中男44例，女18例，年龄(60.83±4.12)岁；病程(9.71±2.61)年，吸烟指数(602.51±52.87)支年。稳定期组(n=56)，病情稳定，控制良好；其中男40例，女16例，年龄(60.51±3.96)岁；病程(8.94±2.25)年，吸烟指数(563.38±49.35)支年。另随机选择同期医院健康体检者60例作为健康对照组，其中男46例，女14例，年龄(61.10±4.29)岁，吸烟指数(326.54±39.21)支年。 3组研究对象在性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)；加重期组、稳定期组COPD患者吸烟指数、病程差异无统计学意义(P>0.05)，但吸烟指数均大于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。本研究经医院医学伦理委员会审核通过，全部受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测指标与方法

1.2.1 肺功能检测：按照肺功能检查操作规范对COPD患者进行常规检测，主要检测指标包括：第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1占预计值百分比(FEV1Pred%)、用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)。

1.2.2 微生物病原学鉴定：参照《临床检验操作规程》[13]中的规定，采用VITEK-2全自动微生物鉴定系统对送检痰液标本中的微生物进行病原鉴定。

1.2.3 Th17、Treg 细胞数量及IL-17、IL-22水平检测：采集患者空腹静脉血3 ml，加入淋巴细胞分离液后梯度离心得到外周血单个核淋巴细胞(PBMCs)，随后采用流式细胞术对患者外周血中的Th17、Treg 细胞数量进行检测，由软件自动得出其结果。血清IL-17、IL-22水平检测采用ELISA法，均按照试剂盒说明书中规定的步骤进行。

2 结 果

2.1 COPD患者急性加重期病原分布 62例急性加重期患者痰液标本共分离出病原65株，其中革兰阴性44株，占67.69%，包括铜绿假单胞菌18例，肺炎克雷伯菌11例，大肠埃希菌9例，其他细菌6例；革兰阳性菌21株，占32.31%，包括金黄色葡萄球菌8例，肺炎链球菌7例，其他细菌6例。

2.2 3组肺功能指标比较 加重期组、稳定期组FEV1、FEV1/Pred、FVC、FEV1/FVC均低于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；加重期组FEV1、FEV1/Pred、FVC、FEV1/FVC均低于稳定期组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 3组肺功能指标比较

2.3 3组血清Th17、Treg细胞水平改变比较 加重期组Th17水平高于健康对照组(P<0.01)，稳定期组与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)；加重期组、稳定期组Treg均低于、Th17/Treg均高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；加重期组Th17、Th17/Treg高于稳定期组，Treg低于稳定期组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 3组血清Th17、Treg细胞水平改变比较

2.4 3组血清炎性因子改变比较 加重期组、稳定期组IL-17、IL-22、TGF-β1均高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；加重期组IL-17、IL-22、TGF-β1均高于稳定期组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 3组血清炎性因子改变研究

2.5 外周血Th17、Treg细胞水平对COPD患者急性加重期细菌感染诊断价值分析 ROC分析结果表明，Th17、Treg及Th17/Treg水平对COPD患者急性加重期发生细菌感染具有良好的诊断价值(AUC均>0.75，P均<0.05)，见表4。

表4 外周血Th17、Treg细胞水平对COPD患者急性加重期细菌感染诊断价值分析

3 讨 论

细菌感染是导致COPD患者急性加重的主要原因，由于抗菌药物的广泛使用，不同地区、医院之间病原分布可能存在差异，了解其分布变化对医生抗感染治疗的合理用药和减少菌株耐药的出现具有重要的价值。本研究结果显示，AECOPD发生细菌感染以革兰阴性菌感染为主，这与已有的报道一致[14-17]。AECOPD患者往往伴随着常年的香烟烟雾对肺部和呼吸道的长期刺激，使得呼吸道上皮细胞化生，增加了COPD疾病期间的黏膜炎性反应，也影响了机体对微生物的免疫反应。动物模型实验结果表明[18]，香烟烟雾暴露产生的T细胞可能具有致病性，将接触香烟烟雾小鼠产生的T细胞转移到重组激活基因2(Rag-2)缺陷型小鼠中可以诱导肺气肿表型，而与随后的受体小鼠吸烟无关。本研究结果中COPD稳定期组和加重期组吸烟指数明显高于健康对照组，提示常年大量的吸烟习惯是导致AECOPD的直接原因。

T淋巴细胞是COPD中炎性反应的关键成分，Th17细胞是最近描述的效应T细胞亚群，主要分泌包括IL-17、IL-22、TGF-β1在内的多种细胞因子，几种炎性因子与自身免疫性疾病的发病机制有紧密联系。 IL-17是一种促炎性细胞因子，其家族由6个成员组成，但抗菌活性主要与IL-17A、IL-17F和IL-17A / F异二聚体成员有关[19-20]。IL-17可通过趋化因子CXCL8和CCL20的分泌来调节炎性反应细胞(包括嗜中性粒细胞和淋巴细胞)向炎性反应组织的募集[21]。此外，IL-17对大多数实质细胞具有影响，包括表达IL-17受体的巨噬细胞和树突状细胞(DC)，并且IL-17介导的信号传导诱导靶细胞产生各种炎性介质，例如TNF-α和IL- 6[22-23]。此外，IL-17在鼠肺上皮细胞中的过表达会导致单核细胞积聚并产生黏液，IL-17转基因小鼠诱导了许多趋化因子和MMP-9的表达[24]。在香烟烟雾引起的肺气肿动物模型中，暴露于慢性烟雾的小鼠在BAL中具有明显更高的IL-17和IFN-γ产生细胞数量。相比之下，COPD患者和对照组的痰中IL-17水平无明显差异[25]。Th17细胞还产生IL-22，IL-22与类风湿性关节炎和牛皮癣等慢性炎性疾病有关，并且在宿主防御肺部细胞外细菌感染中起重要作用[26]。研究表明，COPD患者支气管上皮细胞中IL-22阳性细胞的数量增加，在细菌感染期间，IL-22与IL-17A协同作用以诱导抗菌肽和趋化因子的产生[27]。在COPD患者或鼠肺气肿模型中，肺细胞CD4或CD8 T细胞的扩增具有寡克隆性，戒烟之后，这种反应仍然持续。对T细胞受体(TcR)的分析也揭示了COPD患者肺部CD4 T细胞的寡克隆性。这些研究表明，由抗原特异性T细胞向肺部募集所介导的细胞免疫可能在COPD的发病机制中起关键作用[28-30]。

目前没有直接证据表明Th17/Treg参与了COPD患者发生的气道阻塞，但是大多数临床研究表明，COPD中Th17细胞数量和细胞因子水平与对照组相比明显更高[31-32]。由于小鼠的最大呼气流量的测量较为困难，有学者使用了对甲胆碱吸入后的抵抗力的测量作为FEV1在小鼠模型中的替代指标，以评估小鼠实验模型中的气道阻塞，结果表明，COPD患者气道对吸入的甲胆碱反应频繁，并且与气道阻塞有关[33]，同时不同的鼠模型均显示气道高反应性的发展呈IL-17A依赖性，这与暴露于香烟中的COPD小鼠的组织学结果一致[34]，从而证实了IL-17可参与COPD的高气道反应。此外，在COPD患者的痰液中也观察到IL-17A浓度与中性粒细胞计数呈正相关，IL-17A对于暴露于香烟烟雾中的小鼠小气道纤维化和炎性反应至关重要，这表明该细胞因子在COPD期间对气道阻塞具有促进作用[35]。这些实验数据表明，发生持续性炎性反应的肺部组织通过免疫细胞产生的Th17细胞因子及中性粒细胞的募集而参与了COPD患者气道阻塞的发展，从而导致了AECOPD的发生。本研究结果还显示了外周血Th17/Treg细胞水平对COPD患者急性加重期细菌感染具有一定的诊断价值，由于病例数相对较少，各统计结果可能存在一定的偏倚，机体Th17/Treg平衡作为COPD患者免疫靶向的治疗仍有待进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

侯英宇：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；刘晨阳：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;张丹梅：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;杨敏：进行统计学分析