窖泥指标分析与质量评价机制研究

任良栋 ，郭维伟，陆奉勇，王 琪，付良辉，陆 捷，王瑞明

（1.济南瑞丰生物工程有限公司，山东济南 250353；2.齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南 250353)

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，具有悠久历史，是中华民族的灿烂瑰宝。近年来中国白酒发展迅速，特别是茅台、五粮液等高端白酒企业快速发展，产值达千亿规模。其中浓香型白酒市场占有率在80%以上，窖池固态发酵、续糟配料、混蒸混烧，是浓香型白酒生产特色。千年老窖万年糟，好窖出好酒，窖泥质量的优劣直接决定着浓香型白酒的质量。为保证窖泥在使用过程中的质量，加强窖泥管理，需对窖泥进行定期检测、维护和保养，为窖泥微生物提供适宜的生长栖息环境，这其中对窖泥的全方位了解是前提，因此建立一套系统的、完善的、易于操作的窖泥评价方法非常重要[1-4]。目前，对窖泥的检测及评价方法研究较多，通过感官指标、理化指标和微生物指标判定窖泥质量应用较广[5-6]，但该评价体系中的部分指标并不能真实反映窖泥质量状况。还有些方法利用分子生物学手段检测窖泥中微生物群落结构和多样性[7-8]，该方法所需设备较为专业，对检测人员知识水平要求高，很难适用于绝大多数企业。

本实验通过采集全国有代表性的46份窖泥，对窖泥感官指标、理化指标和微生物指标归纳总结各白酒企业窖泥数据，结合窖泥质量制定了一套以“窖泥产酸能力”和常规检测相结合的窖泥质量判定体系，实验方法简单，可操作性强。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

窖泥样品：取自不同地区的名优浓香型白酒厂。将新鲜窖泥平摊于白瓷盘上，均匀风干、粉碎、过筛后备用。

己酸菌培养基：乙酸钠5 g/L；酵母粉5 g/L；硫酸铵4 g/L；磷酸氢二钾0.2 g/L；硫酸镁0.2 g/L；碳酸钙5 g/L。

2 %（w/v）硫酸铜溶液：取2 g硫酸铜，溶解到100 mL蒸馏水中。

1.2 实验方法

1.2.1 水分、pH值、腐殖质、氨态氮的检测

参照《微生物与浓香型大曲酒生产技术》[9]。

1.2.2 窖泥产酸能力测定

1.2.2.1 测定步骤

（1）取3个500 mL三角瓶，用蒸馏水配制成1500 mL培养基，平均每瓶加450 mL，封口后，121 ℃灭菌30 min。

（2）待3个500 mL三角瓶培养基降温至32～34 ℃时，放入无菌操作台或无菌接种室紫外线灭菌20 min。

（3）称取50 g窖泥分别加入3个三角瓶中，每瓶各加12.5 mL 95 %vol乙醇，封口后放置恒温箱中，温度32～34 ℃，培养7 d。

（4）前1～4 d，三角瓶中出现大量气泡，8 d时检测己酸含量。

1.2.2.2 测定方法

己酸定性检测：首先取培养好的三角瓶中菌液3 mL放入比色管中，再加入2%的CuSO41 mL，然后加入乙醚2 mL，盖好后摇均匀，静置3 min，即看到比色管中分层，上层为绿色或淡绿色，表明有己酸产生，颜色越深，产己酸的量越大。

己酸定量检测：发酵液预处理（1000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm超滤膜过滤后待用）后采用GB 1886.120—2015己酸检测的方法测定。

1.2.2.3 定义

窖泥产酸能力：窖泥培养7 d后，100 mL窖泥培养液中生成的己酸毫克数，单位为mg/100 mL。

1.2.3 梭菌数测定方法

稀释平板法[10]。

2 结果与分析

2.1 不同厂家窖泥水分含量的比较

窖泥风干样品见图1。将窖泥样品进行水分含量测定，46份总样品测定结果见图2，水分含量分布图见图3。

通过对46份窖泥水分的测定结果可以看出，各酒厂窖泥的水分含量参差不齐，其中水分含量在30%以下的有7家，占总数的15.22%，这部分窖泥由于水分含量低，感官上已经出现板结状态，极易老化；另外水分含量在30%～40%的窖泥有28家，水分含量40%以上的有11家。水是微生物生长繁殖必不可少的条件，水分过少，微生物生长代谢困难，己酸菌易失活，窖泥容易老化板结；水分过大，窖泥则过湿、搭窖困难，池壁窖泥易滑落[11]。因此，水分含量在30 %以下的窖泥应该及时补充水分，建议每排酒醅出池后，用优质己酸菌液养护，一方面可提高窖泥中水分含量，另一方面也提高窖泥中己酸菌等有益菌的数量。

2.2 不同厂家窖泥pH值的比较

窖泥是多种微生物栖息繁殖的场所，在白酒酿造过程中，窖泥中微生物不断生长代谢，产生己酸、乳酸、丁酸等大量有机酸，并通过窖泥进入酒醅中。如若窖泥酸度过大，会影响微生物细胞膜电荷变化，对窖泥微生物生长代谢产生抑制作用[12]。各厂家窖泥pH值情况见图4、图5。

从检测结果可以看出，46份样本窖泥绝大多数都在合理范围内，其中pH值在5.5以上的占比达78.46 %，这说明大部分酒厂在窖泥的制作及养护方面都做了不少工作；有17.39%的窖泥pH值呈弱碱性，闻气味有氨味，可能是窖泥制作时碱性无机盐添加过量或者感染了部分产氨细菌所致；另外还有19.57 %的窖泥pH＜5.5，酸性偏大，阻碍了窖泥中己酸菌的生长与代谢，pH值过低的原因主要与养护不当有关，如使用含酸多的黄水和酒尾养护等，导致窖泥酸化、钙化、甚至板结。

2.3 不同厂家窖泥腐殖质含量的比较

腐殖质是动植物残体经微生物分解转化形成的胶体物质，是土壤有机质的主要组成部分(50%～65%)。腐殖质主要由碳、氢、氧、氮、硫、磷等营养元素组成，腐殖质具有适度的黏结性，能够使黏土疏松，砂土黏结，是形成团粒结构的良好胶结剂[13]。窖泥中腐殖质是窖泥微生物的生长繁殖的基本养分，经微生物酶代谢后形成多种有机大分子化合物，使窖泥具有良好的保水性，其含量高低可以判断窖泥质量的优劣。

图6显示窖泥腐殖质含量相差较大，这和各企业窖泥制作方案各不相同有关，有些企业为了追求窖泥臭添加大量的烂水果及动物组织，虽然腐殖质含量很高，但是出酒品质不高，有些酒带有明显的泥臭味；同时有部分企业在制作窖泥时腐殖质加的太少，窖泥腐殖质含量不足2%，造成了窖泥失水，易老化板结。从图7可以看出，大部分窖泥的腐殖质含量都在合理水平，其中窖泥腐殖质含量＞5%的占比46 %，窖泥腐殖质含量≥2 %≤5 %的占比43%，另外也有5家窖泥腐殖质含量不足2%，占到总样本11%。

2.4 不同厂家窖泥氨态氮含量的比较

氨态氮的主要来源于窖泥中大曲、豆饼、硫酸铵等，是窖泥中微生物生长、代谢所必需的速效氮源，在人工窖泥培养时加入量要适中，其含量随着窖泥窖龄的延长不断升高[14]。氨态氮含量少窖泥营养匮乏，窖泥微生物生长受抑制，过剩则容易导致泥臭味明显，各厂家氨态氮检测结果见图8、图9。

根据窖泥理化、微生物指标评定体系[3]，100 g绝干窖泥中氨态氮含量在80～250 mg之间为宜。通过对样本窖泥氨态氮的检测，发现有一半厂家的窖泥氨态氮含量是非常合适的，说明大部分厂家人工窖泥培养氨态氮加入量比较适宜；有43 %的厂家窖泥氨态氮含量＞250 mg/100 g，这与窖泥窖龄比较长和人工窖泥氨态氮物质加入量都有关；有7%的厂家窖泥中氨态氮含量不足80 mg/100 g，氨态氮含量过低，窖泥营养匮乏，窖泥功能菌生长繁殖受阻，窖泥质量不高。

2.5 不同厂家窖泥产酸能力的比较

窖泥中微生物的生长、代谢、繁殖以及相互作用造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒典型风格[15]。己酸乙酯是微生物产生的己酸和乙醇在生物酶作用下形成的香气成分，己酸产生菌的产酸能力决定着己酸生成量，其中克氏梭菌（Clostridium kluyveri）是主要的产己酸微生物之一[16-17]。通过本公司对窖泥微生物多年的检测发现，各窖泥在菌落总数方面差异不大，该指标不能清晰反映窖泥质量。而通过对窖泥培养测定己酸产量可以反映出窖泥中产己酸的克氏梭菌数量和活力。

图10是窖泥培养7 d后己酸定性检验结果，大部分窖泥产酸能力不错，产酸强的窖泥乙醚层呈深绿色，也有部分窖泥乙醚层不显色。进一步对窖泥培养液进行己酸定量检测的结果见图11，窖泥产酸能力相差很大，其中产酸能力在300 mg/100 mL以上的有15家窖泥，占32.6%；产酸能力在200～300 mg/100 mL的有9家，占19.56%；产酸能力在100～200 mg/100 mL的有15家，占32.6 %；产酸能力在100 mg/100 mL以下的有7家，占15.22%。根据窖泥培养液定性和定量检测结果，把窖泥分为4个等级，划分结果见表1。

表1 窖泥产酸等级划分

产酸能力在300 mg/100 mL以上的窖泥培养液，乙醚层颜色最深，产酸能力不足100 mg/100 mL的窖泥培养液，乙醚层无颜色。因此窖泥经过培养后，硫酸铜显色反应可以作为窖泥产酸能力强弱的判定指标，该方法简单易行。为了验证该判定指标的实际意义，研究了窖泥产酸能力和窖泥中梭菌属量的关系图及不同产酸能力窖泥出酒指标比较。

2.6 不同产酸能力窖泥梭菌数比较

窖泥中微生物种类繁多，其中梭菌是常见的窖泥可培养微生物，能有效水解淀粉和蛋白质，促进酿酒微生物的生长繁殖，能产生己酸、丁酸等有机酸，是窖泥重要的产酸和产香菌，其中常见的有己酸菌、丁酸菌等[18]。研究表明，梭菌产生的丁酸和己酸等酸类物质是白酒重要的风味化合物丁酸乙酯和己酸乙酯等酯类化合物的重要前体物质[19]。因此窖泥中梭菌的数量在一定程度上反映出窖泥的产酸产香能力。窖泥梭菌的数量和窖泥产酸能力之间的关系见图12。

通过对样本梭菌数和窖泥产酸能力进行数据分析，发现两者之间存在线性关系，从图12可以看出，产酸强的窖泥中梭菌数相对较多，随着梭菌数量的减少，窖泥的产酸能力逐渐变弱。当梭菌数在10万级单位时，窖泥产酸能力非常弱，甚至己酸定性实验已经反映不出己酸的产生。实验结果表明，窖泥产酸能力的测定可以反映出窖泥中梭菌的数量，对研究窖泥质量具有指导意义。

2.7 不同产酸能力窖泥出酒指标比较

浓香型白酒中四大酯（乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯）的含量和比例是白酒品质的重要参考因素，其中己酸乙酯的含量是各厂家内控质量指标。窖泥是浓香型白酒的基础，是己酸乙酯形成最为重要的因素。为研究窖泥产酸能力和出酒品质的关系，通过对同一时间段不同窖泥厂家的混合原酒进行取样，测定白酒中四大酯含量，实验结果见图13。

由实验结果可以看出，不同窖泥产酸能力对原酒四大酯含量影响较大，其中己酸乙酯变化最明显，窖泥产酸能力越强原酒中己酸乙酯含量越高，己酸乙酯含量平均407.5 mg/100 mL，随着产酸能力的下降，原酒己酸乙酯含量也逐渐降低，其中不产酸窖泥的原酒乙酸乙酯已经降到100 mg/100 mL以下；乙酸乙酯和乳酸乙酯的变化正好相反，随着窖泥产酸能力下降，乙酸乙酯和乳酸乙酯逐渐升高，其中以乳酸乙酯升高最为明显，说明窖泥产酸能力下降后，窖泥中梭菌数量减少，导致乳酸菌等杂菌大量繁殖，打破了白酒四大酯平衡，白酒质量明显下降。从该项研究可以得出结论，窖泥产酸能力指标可以作为判断原酒中四大酯尤其是己酸乙酯的含量，可以作为评判窖泥质量优劣的判定指标之一。

3 讨论

好窖出好酒，优质窖泥是生产优级浓香型白酒的基础，通过检测分析窖泥的各项指标，采用人工干预方式，弥补窖泥缺陷是白酒生产企业必备技能。对46家白酒企业窖泥的感官、理化、微生物及产酸能力做了系统分析论证，研究了窖泥的感官、理化指标、产酸能力与浓香型白酒质量的相关性。窖泥检测结果表明，在对窖泥感官及理化指标评定的基础上，对窖泥产酸能力指标进行检测分析，可以客观评价窖泥的质量优劣。利用窖泥产酸能力测定替代传统窖泥的窖泥菌落总数及梭菌计数，结合窖泥感官指标和理化指标，判断窖泥质量。该方法成本低、操作简单、结果可靠，适用于白酒企业窖泥质量的检测，尤其是提高了中小白酒企业窖泥检测的可行性。