组蛋白修饰在酒精成瘾中的作用及机制

唐晓欢，邓媛，顾悦，吴天辉，孟怡然，孙荣基，彭澎

（云南省药物依赖防治研究所，昆明 650228）

酒精作为一种中枢神经抑制剂，是流行最广的社会性成瘾物质。据世界卫生组织（WHO）发布的《2018年全球酒精与健康状况报告》指出，2016 年全世界有约300 万人因有害使用酒精而死亡，占全球死亡总数的5.3%。有害使用酒精与多种疾病和损伤相关，增加意外事故风险，对个人、家庭以及社会都造成了巨大的损失。酒精成瘾是一种严重的精神疾病，对人体产生多方面的影响。本文从表观遗传学的角度对酒精使用及成瘾进行综述，介绍酒精对组蛋白修饰的影响及其作用机制。

1 酒精代谢及成瘾过程

酒精是影响大脑发育最重要的神经毒性化合物之一[1]，通过肝脏中的氧化途径和肝外组织中的非氧化途径代谢。直接参与酒精代谢的酶是乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）[2]，酒精在ADH 的催化下产生乙醛，乙醛是一种高活性毒性分子，对DNA 高度反应，损害染色体和使干细胞发生突变[3]，乙醛随后在线粒体中代谢为醋酸，并生成高还原性的细胞环境，促进氧化还原反应发生[4]。细胞凋亡是正常的细胞发育过程，可消除异常活跃的神经元，然而，酒精作为N-甲基- D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂和γ-氨基丁酸（GABA）激动剂，会在大脑中不恰当地触发这一过程，在细胞中引发强烈的应激反应[5]，氧化应激除了会引起染色体异常，还会导致酶的功能障碍[3]。神经影像学研究已确认产前酒精暴露会引起脑结构异常，如大脑和小脑体积减少，胼胝体发育不全，海马体积减少等[5]。

酒精使用障碍（AUDs）是一种慢性复发性脑病[6]，其特征是：①对酒精摄入失去控制；②强迫性使用酒精；③与吸毒有关的行为；④社会和职业问题；⑤渴求感；⑥耐受性和戒断症状[7]。与其他滥用物质相比，酒精的效力较弱，但对谷氨酸、GABA、多巴胺和内源性阿片受体等多种神经系统具有普遍影响[8]，产生中枢系统抑制作用、抗焦虑作用、奖赏作用等。长期慢性使用酒精会使中枢神经系统发生适应性改变，出现依赖、戒断反应等[9]。Koob 等人提出的酒精成瘾“非稳态理论”，指的就是长期和过度的酒精接触能够引起大脑功能适应性变化，导致调节系统偏离稳态[10]。

2 表观遗传及调节机制

生物体的遗传信息分为基因型和表型，基因型就是DNA 碱基序列的改变，直接反映在生物体的遗传信息表达上。表观遗传是指不改变DNA 序列，而是对基因调控的影响因子进行结构和功能的修饰，从而改变基因表达[11]。与不灵活的基因组不同，表观遗传机制对环境的干扰很敏感，是转录的主要调节器[3]，也是单个基因组能产生细胞多样性的基础[2]。有研究提示表观遗 传修饰可通过种系和多代传递[6]，影响生物体的繁殖特性[11]。表观遗传修饰极其稳定，这可能是成瘾行为长期存在的分子基础之一。当基因变异不能完全解释复杂疾病（如AUDs）的所有遗传现象时，表观遗传可能“填补空白”，更好地解释复杂疾病的遗传机制[6]。

表观遗传调节机制主要有DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA 等[12]。核DNA 和蛋白质之间的复合体叫做染色质，染色质的基本组成单位是核小体，核小体的核心由组蛋白H2A、H2B、H3、H4 各一对组成，周围围绕着146 bp 大小的DNA[13]，核小体是真核生物染色质的基本结构，染色质即是由DNA、组蛋白和非组蛋白组成的纤维结构。表观遗传机制以环境敏感的方式改变转录程序，这些机制不改变DNA 序列而是通过DNA 和组蛋白尾的化学修饰来影响基因表达[14]，并相互协同调控[5]。

3 组蛋白修饰

组蛋白（H）是一种小蛋白质，含有高比例的碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸），有助于与负电荷DNA 分子结合，组蛋白主要有五种亚型：H1、H2A、H2B、H3和H4[1]。每个组蛋白的N-末端氨基酸都能发生大量共价修饰，即组蛋白修饰[15]。组蛋白修饰是控制DNA 修复、复制和转录的重要表观遗传机制，包括甲基化（精氨酸和赖氨酸残基）、乙酰化（赖氨酸残基）、磷酸化（丝氨酸和苏氨酸残基）、泛素化、素酰化、adp-核糖化（赖氨酸残基）和脯氨酸异构化等[4]。不同修饰发生的位点略有不同，与不同的酶催化不同反应相关[16]。组蛋白修饰并不是静止不动的，而是根据酶的不同调控处于高度动态中[15]，并且不同的修饰方式会产生不同的效果[17]。

3.1 组蛋白乙酰化

乙酰化是组蛋白修饰的主要机制之一[18]，发生在核小体组蛋白核心突出的N 端赖氨酸残基上。乙酰基的供体是乙酰辅酶A，组蛋白亚基的尾部插入DNA 的小槽中，并通过双螺旋延伸，参与转录激活（乙酰化）或抑制（去乙酰化）。当带正电荷的氨基酸如赖氨酸，被定位在组蛋白的氨基末端时，添加带负电荷的乙酰基中和了赖氨酸的电荷，减弱了核小体和组蛋白尾之间的相互作用，打开核小体，使转录复合体接触DNA 模板从而进行基因转录。相反，乙酰基的去除使核小体装配更紧密，阻止了转录机制的进入，沉默基因表达[4]。催化这些反应的是组蛋白乙酰化酶（HATs）和去乙酰化酶（HDACs）[19]。HDACs 根据不同亚型的序列相似性和细胞定位又可分为四类：Ⅰ类HDAC（1、2、3、8），Ⅱ类HDAC（4、5、6、7、9、10），Ⅲ类HDAC 也称为sirtuins，由SIRT 1-7 组成，HDAC11 属于Ⅳ类[10]。

乙酰化多发生在组蛋白H3 和H4 的特定赖氨酸残 基 上， 如H3K9、H3K14、H3K18、H4K5、H4K8、H4K12[18，20]。H4K5 和H4K12 乙酰化是记忆相关基因表达的关键标记，表观遗传机制已被证明在记忆和学习过程中发挥作用。产前和哺乳酒精暴露可引起前额叶皮质（PFC）H4K5 和H4K12 乙酰化水平增加，而在海马体（HPC）中只有H4K5 乙酰化水平增加，这表明发育性酒精暴露会导致大脑中特定区域的表观遗传改变，酒精对组蛋白乙酰化的作用也具有组织、细胞和脑区特异性[4]。此外，PFC 中的H4K5 乙酰化水平与母亲饮酒水平相关，表明酒精对H4K5 的乙酰化存在剂量依赖效应。在啮齿动物模型中，急性乙醇暴露与杏仁核HDAC 活性下降和H3 和H4 乙酰化增加有关，在酒精戒断期可出现杏仁核HDAC 活性增加和组蛋白去乙酰化，而该脑区HDAC 活性增加、戒断引起的焦虑行为和神经肽Y（NPY）表达缺陷可通过使用HDAC 抑制剂Trichoatin-a 来纠正[21]，NPY 是一种在杏仁核区域高度表达的神经肽，有证据表明，较高的NPY 水平能减少酒精使用，较低则会促进酒精使用。其他动物研究也表明，使用HDAC 抑制剂和通过siRNA 敲除HDAC 可以改善酒精引起的焦虑和酒精中毒，提示HDAC 抑制剂对AUDs 有治疗潜力[6]。MMP-9 是一种明胶酶，已被证实在学习、记忆以及毒品滥用等各种神经可塑性现象中起重要作用，殷丽天等研究发现，HDAC6 可调控 MMP-9 的表达，影响海马突触可塑性，最终使小鼠酒精依赖效应增强[22]，Tubastatin A 及其衍生物是已报道活性、选择性和类药性最高的HDAC6 抑制剂[23]，具有重要的潜在治疗价值。非特异性HDAC 抑制剂丁酸钠（NaB）能够预防和逆转乙醇诱导的行为敏化和基因表达，NaB 的治疗显著减轻了依赖大鼠的过量酒精摄 入[10]。总的来说，HDAC 抑制剂的治疗作用是对HDAC 有抑制作用的小分子通过血脑屏障进入中枢神经系统，发挥抗炎和神经保护功能，帮助恢复染色质重塑，改善异常突触的可塑性，防止焦虑样行为，增强记忆形成，并且在认知功能减退的神经疾病中也显示出了很好的治疗效果[1]。因此酒精能改变组蛋白的乙酰化水平，而组蛋白的乙酰化水平改变又反过来影响酒精的摄取[22]。

酒精不仅影响脑组织遗传因子，还对生物体重要器官的生长发育产生关键作用，妊娠和哺乳期接触酒精会明显改变基因遗传印迹、神经胶质发育、细胞周期调控和神经系统生长[1]。母亲在怀孕期间饮酒可能导致胎儿酒精综合征[12]，该综合征中最严重的影响之一就是心脏发育畸形。与胎儿心脏发育密切相关的是组蛋白H3[24]，组蛋白乙酰化失衡会导致干细胞心肌样分化障碍[25]。H3K9 乙酰化对染色质结构、基因表达和细胞凋亡起重要作用，也是基因活化的重要标志之一。心脏的发育过程中有很多转录因子参与其中，最关键的核心转录因子是GATA4 及Mef2c[26]，酒精可能通过干扰 CBP/p300 介导的GATA4 和NKX2.5 启动子区域H3 乙酰化修饰，引起表突变，CBP/p300 是HATs 家族的重要成员，可以调节染色质结构[4]，核心因子不管是质还是量的轻微改变都会对心脏发育造成严重影响。同时H3K9乙酰化的正常时序性也被扰乱，发生转录错误。彭昌等的研究结果显示姜黄素可通过抑制CBP/p300 在启动子区域的结合来降低H3 的高乙酰化，进而下调GATA4、NKX2.5 基因表达水平[27]。酒精不仅通过孕母对胎儿造成影响，孕前父亲如果持续大量摄入酒精也会导致胎儿生长发育异常。路倩等就针对父代小鼠饮酒是否会对子代心肌组织生长发育产生影响进行了研究，结果显示子代小鼠心肌组织中促凋亡蛋白caspase-3 启动子区域H3K9 乙酰化水平升高，同时抑凋亡因子Bcl-2 相同区域H3K27 乙酰化水平显著降低[28-29]，提示组蛋白修饰如果发生在不同氨基酸位点，即可动态调控一对相互拮抗基因的转录，对基因表达起到不同作用。

3.2 组蛋白甲基化

同乙酰化一样，组蛋白甲基化也是最具特征、最多的修饰之一[16]。组蛋白甲基化是控制基因表达、干细胞成熟、遗传印迹和细胞有丝分裂的主要染色质修饰[4]。甲基化多发生在赖氨酸和精氨酸残基上，包括H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H4K2 等位点[30]。组蛋白甲基化受甲基转移酶（HMT）和去甲基化酶调控 （KDM）[16]。有超过50 种人类HMT 和约30 种KDM[14]。组蛋白甲基化可以促进或抑制转录，这取决于被修饰的特定氨基酸残基[24]。H3K4 的甲基化通常与基因诱导相关，而H3K27 的甲基化使染色质浓缩，抑制基因表达[14]，如H3K4 二甲基化（H3K4me2）、三甲基化（H3K4me3）和H3K36me3 参与了基因的转录和激活，而且这种激活作用在H3K9 和H3K14 乙酰化作用存在时还会得到一定程度的加强[16]。有趣的是，H3K9me2和H3K9me3 与基因激活有关，H3K9 和H3K27 的单甲基化与其二甲基化和三甲基化相比，则以相反的方式调节基因转录，这表明修饰的效价在调控染色质结构时也很重要[10]。已有研究表明，急性酒精暴露后，大鼠的HDAC 活性下降，引起H3K4me3 增加，而H3K9me2减少，不止动物实验，在酒精成瘾者NAc 中也观察到了H3K9me2 减少，而海马组织中H3K4me3 的水平升高，说明H3K9me2 和H3K4me3 与酒精依赖有关[11]。同样的改变也出现在可卡因依赖者的脑部结构中，提示酒精和可卡因的表观遗传调节机制有共性，其他易成瘾物质是否也具有相同的调节机制尚待研究[31]。

HMT 和KDM 协同调控组蛋白甲基化过程，研究证明了HMT 在可卡因和吗啡成瘾的神经适应中起因果作用，组蛋白甲基转移酶PRDM2 参与了背外侧前额叶皮质（dmPFC）的转录，导致了酒精成瘾的发展。而有研究发现组蛋白去甲基化酶KDM6B（也称为JMJD3）在酒精依赖的啮齿动物和人类大脑中存在特定区域的持续失调。KDM6B 在小胶质细胞（大脑中的常驻免疫细胞）中富集，调节免疫应答基因对炎症刺激的诱导，酒精会增加促炎细胞因子的转录，炎症细胞因子的持续升高已被证明会增加对酒精的渴望和依赖程度，炎症越来越被认为是酒精成瘾发展的基础。体内KDM6B 蛋白在急性酒精暴露、耐受和依赖、急性戒断和延长使用的过程中受到动态调节，KDM6B 可去除H3 上的三甲基标记，调节炎症基因的转录。抑制炎症的化合物在治疗酒精成瘾的临床试验中已取得了成功，KDM6B 靶向化合物可同时纠正表观遗传和神经炎症信号过程，有望在AUDs 治疗中发挥关键效用[14]。

组蛋白甲基化可开启或沉默心脏相关核心转录因子的转录，因此同样在心脏发育中起到了举足轻重的作用。前文提到H3K9 乙酰化与心脏发育有关，H3K9 三甲基化同样重要，而且还与心肌肥厚及心力衰竭等病理生理过程息息相关。罗孝美等研究结果表明，母亲孕期饮酒可使H3K9me3 水平显著降低，引起GATA4 的过表达，与此同时Cx43、β-MHC 等心脏发育下游因子也会受到影响[24]。提示酒精暴露所致的心脏发育异常不仅与乙酰化有关，甲基化修饰也起到了至关重要的作用。

3.3 组蛋白磷酸化

组蛋白磷酸化由蛋白激酶介导，多发生在苏氨酸和丝氨酸残基上，与转录激活、DNA 修复有关，有时还参与到细胞周期动力学中。H3 磷酸化可调节某些重要的神经通路，如在H3 的丝氨酸10 位上（H3S10）阻断磷酸化可减弱对可卡因和吗啡的行为反应。精神兴奋剂如苯丙胺、可卡因以及吗啡均可增加组蛋白H3S10 的磷酸化水平[32]。产前酒精暴露则会导致组蛋白激活标记H3S10 减少[5]。说明组蛋白磷酸化也在一定程度上参与了酒精等物质成瘾过程。

综上所述，酒精流行面广，又与社会文化紧密相连，传统观念里的低害化促成了酒精滥用。长期接触酒精可能通过组蛋白的乙酰化、甲基化和磷酸化等共价修饰途径改变蛋白表达，逐步发展成精神依赖，影响突触可塑性，最终形成长期的神经功能改变[22]。了解酒精在表观遗传方面的作用不仅有助于深入认识酒精成瘾的发生机制，也可为探索新的治疗方式及药物开发提供一定的指导意义。