流式细胞术检测精子凋亡与男性不育症关系研究

孙红勇，林法喜*

（南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029）

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取2018年1月～2020年1月江苏省人民医院男性不育症患者50例，年龄27～49岁，平均（33.5±5.4）岁。在精子症类型方面，弱精子症14例（28.0%），少精子症36例（72.0%）。将这些患者作为不育症组，另回顾性选取同期我院正常生育男性50例作为正常生育组，年龄26～48岁，平均（32.3±5.2）岁。两组男性的一般资料比较差异均不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）性生活均正常；（2）夫妇婚后均同居1年以上。排除标准：（1）女方不孕因素；（2）避孕。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂与设备

购买北京航天瑞麒科技发展有限公司生产的敬业分析仪，美国BD公司生产的FITC-Annexin V/PI荧光染色试剂（货号：556547）。

1.3.2 精子凋亡检测

在离心管中放置标本，将PBS液加入其中，洗涤2次，进行10 min离心，将速率设定为3000 r/min，将上清液去除，在-80℃冰箱中冻存精子备用。在冰水中放置精子标本复温，用冷PBS液对精子悬液进行稀释，在试管中加入约5×106个精子，将PBS液加入，洗涤，进行10 min的离心，将速率设定为3000 r/min，将上清液弃去。用1ml Annexin V Binding Buffer重悬浮，在试管中加入100 μL。将5 μL FITCAnnexin、10 μL PI加入染色，室温下进行15 min避光静置后将400 μL孵育缓冲液加入，终浓度约为1×106精子/mL。1 h内采用流式细胞仪，应用精子动（静）态图像分析系统分析精子密度、活力，将凋亡率（PAS）计算出来，计算方法为凋亡精子数与精子总数的百分率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0，计量资料用（±s）表示，用t检验；应用双变量直线相关分析，将Pearson相关系数计算出来。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 两组男性的精液密度、A级、A+B级精子、凋亡率比较

不育症组弱精子症患者的精液密度显著高于少精子症患者，差异有统计学意义（P＜0.05），凋亡率显著低于少精子症患者，差异有统计学意义（P＜0.05），但弱精子症和少精子症患者的A级精子、A+B级精子之间的差异均不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）。少精子症患者的精子密度显著低于正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05），凋亡率显著高于正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05），但弱精子症患者和正常生育组男性的精液密度、凋亡率之间的差异均不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）；弱精子症、少精子症患者的A级、A+B级精子均显著低于正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组男性的精液密度、A级、A+B级精子、凋亡率比较（±s）

表1 两组男性的精液密度、A级、A+B级精子、凋亡率比较（±s）

组别 精子症类型 密度（×106/mL） A级精子（%） A+B级精子（%） 凋亡率（%）不育症组（n=50） 弱精子症 84.0±13.5 12.8±2.0 25.5±4.9 8.8±1.4少精子症 11.2±2.7 12.8±2.0 23.3±4.7 25.8±4.3正常生育组（n=50） 78.0±14.1 33.3±5.4 49.7±7.5 11.3±2.5

2.2 不育症组患者的精液密度、A级、A+B级精子与凋亡率的相关性分析

不育症组患者的精液密度与凋亡率呈显著的负相关关系，差异有统计学意义（P＜0.05），但A级、A+B级精子与凋亡率之间无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不育症组患者的精液密度、A级、A+B级精子与凋亡率的相关性分析

3 讨 论

细胞凋亡指多细胞有机体由基因控制的细胞主动死亡过程，目的为对机体发育进行调控，对稳定的内环境进行维护。在精子发生过程中，精子凋亡是一个重要特征，在对正常精子数量进行维持的过程中，自发凋亡发挥着极为重要的作用。而诱发过多的生精细胞凋亡这一病理现象是异常的，会直接引发男性不育症。本研究结果表明，不育症组弱精子症患者的精液密度显著高于少精子症患者，凋亡率显著低于少精子症患者。少精子症患者的精子密度显著低于正常生育组，凋亡率显著高于正常生育组；弱精子症、少精子症患者的A级、A+B级精子均显著低于正常生育组。不育症组患者的精液密度与凋亡率呈显著的负相关关系，说明少精子症发生的一个原因可能为精子过量凋亡。

20世纪70年代，流式细胞术发展起来，其能够以较快的速度定量分析单细胞，目前已经在各个领域广泛应用。胞浆、核染色质在细胞凋亡的情况下浓缩，核裂解，促进凋亡小体的产生，相应改变细胞的光散射性质，而在对光散射进行测定的过程中，流式细胞术是极为简单的细胞凋亡检测方法，其一方面能够定性，另一方面还能够定量，具有较快的检测速度、较大的数据采集量、较为客观、全面的分析等，这就将一种较为理想的手段提供给了临床对不同原因引发精子凋亡进行深入研究的工作，同时，在对精子功能、男性生育力进行评估的过程中，流式细胞术也可以作为一种新方法，应用前景极为广阔。

综上所述，男性不育症与流式细胞术检测精子凋亡关系密切，值得临床充分重视。