靶向捕获高通量测序技术在检测早期乳腺癌胚系突变中的应用价值

袁牧歌，吴文坚，胡朝晖，陈嘉昌，于世辉，欧小华，毛琳琳，吴海艳

（1. 广州市金圻睿生物科技有限责任公司，广东 广州 510000；2. 广州医科大学金域检验学院，广东 广州 510000）

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，也是女性因癌症死亡的主要原因[1]。每年全球有100多万人被确诊患有乳腺癌，女性死亡例数超过40万，占癌症死亡总数的14%[2]。基因突变是乳腺癌的重要病因之一，目前美国国立综合癌症网络（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[3]收录的21个基因是被普遍认同的乳腺癌易感基因。易感基因的检测在乳腺癌的预防和诊治过程中具有重要意义，能够指导个体化治疗。相对于Sanger测序，靶向捕获高通量测序技术能够实现快速、精准、低成本的基因检测，同时也能对多个基因和未知序列进行同步测序。本研究旨在检测早期乳腺癌患者的胚系突变，分析突变与病理学特征的相关性，进而指导乳腺癌的临床诊治过程。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取哈尔滨医科大学附属肿瘤医院经病理诊断确诊的99例临床进行化疗的早期乳腺癌女性患者，年龄31～66岁，收集所有患者手术前1～3 d的血浆标本。本研究获得哈尔滨医科大学附属肿瘤医院和金域医学中心伦理委员会的批准，且受试者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 易感基因胚系突变检测 采用QIAamp DNA提取试剂盒（德国凯杰公司）提取血浆标本，采用NanoDrop 2000超微量分光光度仪（美国ThermoFisher Scientific公司）分析其纯度和浓度，保留吸光度（A）260/280为1.8～2.0、浓度为50 ng/μL及以上的标本。采用KAPA文库制备试剂盒（瑞士罗氏公司）制备文库，并用Qubit 3.0荧光定量仪（美国ThermoFisher Scientific公司）测定其浓度。向文库中加入xGen Universal Blockers—TS Mix和Human Cot-1 DNA封闭文库（上海纳昂达生物科技有限公司），将其至于真空抽滤系统干燥成干粉，按照xGen Lockdown Reagents（上海纳昂达生物科技有限公司）说明书进行杂交捕获，采用金域医学中心设计的21个乳腺癌基因探针进行基因检测，这21个基因是NCCN指南[3]收录的乳腺癌易感基因，分别为：ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、EPCAM、NBN、NF1、PALB2、PMS1、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53。用Qubit 3.0荧光定量仪测定其捕获后文库浓度。采用Illumina Nextseq 550 system（美国Illumina公司）对目标DNA进行测序，并进行生物信息学分析。

1.2.2 突变位点筛选和分类策略 去除非编码区突变和同义突变；对比dpSNP数据库、千人基因组、EXAC数据库保留频率＜0.2%的变体；去除低等位基因频率变异（＜30%）。根据《遗传变异分类标准与指南》[4]对筛选后的胚系突变进行分类，分为致病、疑似致病、意义不明、疑似无害、无害5类。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早期乳腺癌患者血浆胚系突变结果

99例早期乳腺癌患者中，有48例患者检测出18个基因的55个突变位点，其中包含45个错义突变、1个无义突变、8个插入缺失突变、1个剪切位点突变，其中BRCA1（p.R504C）和BRIP1（p.L340F）位点分别各有2个标本突变。BRCA基因检测出10个突变位点，包含5个错义突变、1个无义突变、4个缺失突变。见表1。BRCA1突变患者5例（5.0%）；BRCA2（6.1%）突变患者6例，其中4例是三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）。本研究新发现的15个突变位点在ExAC、ClinVar、dbSNP、HGMD数据库中均未提及。见图1和表2。

表2 15个新发现的胚系突变位点

55个突变中有9个（16.4%）为致病性突变（6个插入缺失突变、1个无义突变、1个剪切位点突变、1个错义突变）、4个（7.3%）无害突变、42个（76.3%）意义未明突变。9个致病性胚系突变位点结果见表3。

表3 9个致病性胚系突变位点

2.2 胚系突变与临床病理特征的相关性

99例乳腺癌患者中，3例无分子分型和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor，HER-2）的记录，1例无组织学分级和肿瘤细胞浸润（tumor infiltrating lymphayte，TIL）的记录，1例无病理分期（TNM）的记录。胚系突变在所有不同临床病理特征中差异无统计学意义（P＞0.05），致病性突变在不同年龄、不同增殖细胞核抗原（Ki67 antigen，Ki67）状态中差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 99例乳腺癌患者中致病性突变与临床病理特征的关系 例

3 讨论

与传统Sanger测序相比，靶向捕获高通量测序技术检测乳腺癌21个易感基因的全外显子区域突变位点更加快捷、高效，可弥补其成本高、耗时长等缺陷[5]。目前，乳腺癌易感基因检测缺乏热点区域，所检测的基因片段较长，因此高通量测序技术发挥了巨大作用，该技术能够在分子水平检测到肿瘤易感基因、驱动基因、耐药基因及信号通路等，从而可以给予患者更加精准的个体化治疗。

BRCA1和BRCA2是2个主要的乳腺癌易感基因，其在DNA修复、细胞周期检查点控制、转录调控和泛素化中起重要作用[6]。通过BRCA1、BRCA2基因突变检测，筛查出高风险人群，可以做到早发现、早诊断及早治疗[7]。BRCA1、BRCA2是胚系突变最多的基因，在本研究的99例患者中，11例患者（11.1%）发生了BRCA1、BRCA2突变，其中发生致病性BRCA突变的患者为4例。相关专家共识[8]建议，临床优先考虑使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（AOP-ribose） ploymerase，PARP]抑制剂，如奥拉帕尼，对发生致病性BRCA突变的患者进行靶向治疗。BHASKARAN等[9]关于3万多例中国乳腺癌和卵巢癌患者BRCA1、BRCA2胚系突变的研究结果与本研究高度相似。本研究中，有48例患者检测出胚系突变，在非BRCA1、BRCA2基因中，BARD1的突变最为常见，其次是ATM和NF1；有8例（8.1%）患者至少有1个乳腺癌易感基因的有害突变，除BRCA外，分别是ATM、BARD1、NBN、PALB2。对于ATM和NBN致病性突变的患者，建议每年进行1次乳房X线检查，并考虑从40岁开始进行对比性乳腺磁共振成像[3]。PALB2致病性突变的患者对侧乳腺癌风险增加，建议对这些患者进行乳腺磁共振成像筛查[10]。

本研究发现，21个乳腺癌易感基因发生非致病性胚系突变，在以40岁为界限的不同年龄组中差异有统计学意义，提示40岁之后可能发生致病性突变的概率显著增高，建议40岁开始将乳腺癌易感基因的筛查纳入体检中。非致病性胚系突变在Ki67阳性与否的比较中差异也有统计学意义（P＜0.05），提示致病性突变患者的Ki67阳性概率更高。Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中不可缺少，主要用来判断肿瘤的恶性程度。Ki67的数值越高，说明细胞增殖越活跃，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感，Ki67通常是一个预后不良的标志物[11]。因此，有致病性突变的乳腺癌患者可能恶性程度更高，且预后较差，但对化疗较为敏感。

本研究发现，有38例（38.4%）早期乳腺癌患者至少有1个意义未明突变。这些变体目前没有明确的分类研究，其中大多数最终将被重新分类，可能是无害的，也有可能是致病性的，不应当使用意义未明突变来做出临床决策，应进一步完善分类策略，做出更好的临床决策。

本研究存在一定局限性。首先，所有血浆标本均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，仅反应相应地区乳腺癌人群突变的流行情况；其次，本研究样本数有限，仅能初步确定这些基因突变的频率与临床病理特征之间的相关性。本研究发现了15个新胚系突变，希望这些突变能够成为未来预测乳腺癌风险的新切入点。易感基因胚系突变的检测能够帮助临床预防及诊断乳腺癌，无创性胚系突变检测结合病理检测可进行准确的临床诊断。精准用药和靶向治疗是未来可以进一步研究的方向。