芪红通络颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及其机制研究

高玉菊，杨满琴，王 丽，罗胜勇

(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2.安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061)

缺血性脑卒中是临床常见疾病，重度致残者约占40%，是目前威胁人类健康的三大疾病之一。静脉性药物溶栓治疗是目前缺血性脑血管病治疗的有效措施，但是治疗时间窗狭窄(发病4.5 h以内)，还可能增加脑内出血转化风险，因而限制了其使用。更为关键的是，缺血区血液恢复灌通后又可能进一步加重脑功能障碍，产生脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)。目前，针对CIRI尚无理想的干预措施，因此，充分研究其发生机制，寻求有效的治疗药物对于改善缺血性脑卒中预后具有重要意义。研究表明，氧化应激中产生的活性氧在CIRI的发病过程中起着至关重要的作用。芪红通络颗粒是以活血化瘀、益气化痰为基本治疗大法严谨选药的临床经验方，由红花、黄芪、全蝎、蜈蚣、当归、菊花、鸡血藤、水蛭、僵蚕、白附子共10味中药组成。现代药理学研究提示，红花有保护神经细胞的作用，黄芪能够有效改善抗氧化酶活性，提高神经细胞的抗损伤能力，当归有抗炎、抗氧化的作用。本研究拟通过建立局灶性大鼠CIRI模型，探讨芪红通络颗粒对CIRI的保护作用及其可能的作用机制，以期为芪红通络颗粒治疗缺血性脑卒中提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体质量250～300 g，由安徽医科大学实验动物中心[动物生产许可证号：SCXK(皖)2017-001；动物使用许可证号：SYXK(皖)2019-008]提供。动物购买后适应性饲养1周进行实验。实验室条件：温度18～26 ℃，湿度40%～70%。

1.2 药品与试剂 芪红通络颗粒(批号20181223，每袋10 g)：安徽中医药大学第二附属医院药剂科研制；尼莫地平片(批号20190219，每片20 mg)：山东健康药业有限公司生产；丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(批号20190622)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(批号20190626)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(批号20190916)：南京建成生物工程研究所；2,3,5-氯化三苯四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)：美国Sigma公司；水合氯醛(批号T20170321)：国药集团化学试剂有限公司；兔抗核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)多克隆抗体：美国Cell Signaling Technology。

1.3 仪器 FSH-2可调高速匀浆机：金坛市金南仪器制造有限公司；TGL18W高速台式冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司；MODEL 550酶标仪：美国BIO-RAD公司；BIO-RAD凝胶成像系统：美国伯乐公司；Axioscope A1病理成像系统：德国蔡司公司；UV-240紫外分光光度计：日本岛津公司。

2 方法

2.1 分组及给药 取180只雄性SD大鼠随机分为6组：假手术组，模型组，尼莫地平组(10 mg/kg)，芪红通络颗粒高剂量(10.8 g/kg)、中剂量(5.4 g/kg)、低剂量(2.7 g/kg)组，每组30只。各组模型复制前灌胃给予相应药物3 d，模型复制后给药2 d，每日1次，模型复制后3 d处死大鼠取材。假手术组及模型组给予等容积生理盐水。

2.2 CIRI模型制作 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后仰卧位固定于手术台上。暴露右侧颈总动脉，游离分出颈内动脉及颈外动脉。颈外动脉距离颈总动脉分叉部1 cm处结扎并剪断，动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，于颈外动脉和颈总动脉分叉部0.5 cm处剪开一小切口。用0.24 mm直径的线栓经切口插入颈内动脉，在颈总动脉分叉处前进18～20 mm有轻微阻力感时停止。准确记录此刻时间，栓塞2 h后缓慢撤出线栓，实现再灌注。大鼠苏醒后，手术对侧肢体出现运动障碍作为模型制备成功的判断标准。实验过程中严格控制室温为23～25 ℃，大鼠肛温维持37 ℃左右。假手术组只分离血管，不插入线栓。剔除死亡及出血过多的动物，每组不少于24只大鼠。

2.3 大鼠神经功能缺陷评分 再灌注72 h后每组随机取8只动物，参照Longa五级评分法进行神经功能缺陷评分。0分：无神经功能缺陷症状；1分：不能完全伸展手术对侧前爪；2分：行走时出现向手术对侧转圈；3分：行走时身体向手术对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

2.4 脑梗死体积测定 神经功能评分结束后处死大鼠，取出脑组织，去除嗅球、小脑和脑干，生理盐水冲洗脑组织表面血污，吸干，-20 ℃冷冻10 min使其变硬，沿冠状面切成1.5 mm 厚的脑片，37 ℃条件下置于2% TTC染液中染色30 min，取出脑片于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。最后将每只大鼠脑片整齐排列，拍照保存，红色为正常区，白色为缺血梗死区。采用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0测定每张脑片脑梗死体积及占对侧脑体积的百分比。

2.5 脑组织SOD、GSH-Px和MDA含量测定 从每组剩余大鼠中随机取8只，麻醉处死后取出脑组织，称质量后加入生理盐水，用组织匀浆机制成10%的组织匀浆，离心后取上清液，用生化试剂盒测定SOD、GSH-Px和MDA的含量。

2.6 脑组织病理学检查 从每组剩余的8只大鼠中随机取4只，断头处死后取出缺血侧脑组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后行冠状切片。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin， HE)染色后脱水封片，光学显微镜下观察缺血侧脑组织病理变化。

2.7 Western blot法测定脑组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平 将剩余4只大鼠麻醉后处死，断头，取损伤侧皮质，-80 ℃冰箱中冻存，备用。临用时，取出皮质，加入1 mL冰冷细胞裂解液后用组织匀浆器匀浆3 min，冰浴30 min，随后在4 ℃条件下离心(4 000 r/min)10 min，按文献[9]方法提取总蛋白和核蛋白，取上清液，采用BCA法测定蛋白含量。各组取25 μg总蛋白和25 μg核蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将蛋白由凝胶转印到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h后加入相应的一抗(Nrf2、HO-1)稀释液，4 ℃孵育过夜。次日用TBST缓冲液洗膜3次(每次10 min)，加入二抗孵育1 h，显影后用凝胶成像系统扫描测定。以目标蛋白条带与β-actin条带灰度值比值作为该蛋白相对表达水平。

3 结果

3.1 芪红通络颗粒对大鼠神经功能评分的影响 结果显示，假手术组大鼠未出现明显神经功能缺损；与假手术组比较，模型组大鼠表现出明显的行为学障碍，神经功能评分较高；与模型组比较，芪红通络颗粒高、中剂量组神经行为学障碍症状明显减轻，差异有统计学意义(

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05)。见表1。

表1 芪红通络颗粒对大鼠CIRI后神经功能缺损评分的影响

3.2 芪红通络颗粒对大鼠脑梗死体积的影响 结果显示，假手术组未出现脑缺血情况；与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积明显增大(

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05)；与模型组比较，芪红通络颗粒高、中、低剂量组可明显减少脑梗死体积，差异有统计学意义(

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05)。见图1、表2。

注:TTC染色,红色表示正常区,白色表示梗死区;A.假手术组;B.模型组;C.尼莫地平组;D.芪红通络颗粒高剂量组;E.芪红通络颗粒中剂量组;F.芪红通络颗粒低剂量组图1 各组大鼠脑梗死区情况

表2 芪红通络颗粒对大鼠脑梗死体积的影响

3.3 芪红通络颗粒对大鼠脑组织病理改变的影响 结果显示，假手术组皮质神经细胞、神经胶质细胞排列紧密，形态正常。模型组大鼠皮质神经细胞水肿明显，有溶解现象，细胞核模糊，胶质细胞淡染及缩小，部分有固缩；与模型组比较，尼莫地平组及芪红通络颗粒高、中剂量组可明显减轻上述病理改变，低剂量组作用不甚明显。见图2。

图2 芪红通络颗粒对大鼠脑组织病理变化的

3.4 芪红通络颗粒对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力明显降低，MDA含量明显增加，差异有统计学意义(

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05)。与模型组比较，芪红通络颗粒高、中、低剂量组可明显升高SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量，差异有统计学意义(

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05)。见表3。

表3 芪红通络颗粒对大鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响

3.5 芪红通络颗粒对大鼠脑组织中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中总Nrf2、核Nrf2和HO-1蛋白表达水平有一定升高趋势，但差异无统计学意义(

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05)；与模型组比较，芪红通络颗粒高、中剂量组可明显提高脑组织中总Nrf2和HO-1蛋白表达水平，差异有统计学意义(

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05)，低剂量组作用不明显；芪红通络颗粒高、中、低剂量均可明显升高核内Nrf2蛋白表达水平，差异有统计学意义(

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05)。见图3、表4。

注：A.假手术组；B.模型组；C.芪红通络颗粒高剂量组；D.芪红通络颗粒中剂量组；E.芪红通络颗粒低剂量组

表4 芪红通络颗粒对大鼠脑组织中Nrf2和HO-1蛋白相对表达水平的影响

4 讨论

缺血性脑卒中后如何减轻继发性脑损伤是临床面临的重要课题，其损伤机制复杂，国内外围绕着缺血再灌注后神经细胞损伤与修复机制的研究虽取得一定进展，但仍缺乏有效的治疗方法。中药具有多靶点、多方向及多途径等优点，并且不良反应小，因此充分发掘中医药宝库，从中筛选具有神经保护作用的药物具有重要临床价值。脑梗死体积和神经功能缺陷评分测定是评价脑缺血损伤程度的常用手段，脑梗死体积可直接反映脑损伤程度，而神经功能评分值的高低与脑梗死体积则具有明显相关性。本实验结果显示，芪红通络颗粒可明显减小缺血再灌注损伤后的脑梗死体积，降低神经功能缺损评分，同时对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞出现水肿、溶解及神经胶质细胞淡染、缩小等病理改变也具有明显改善作用，表明芪红通络颗粒对CIRI具有较好的保护作用。

脑组织的氧化应激水平与缺血性脑卒中的发生、发展及转归密切相关，是造成缺血再灌注不可逆损伤的主要因素。因此，降低机体的氧化应激水平是减轻CIRI的重要措施。MDA是不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的终产物之一，可反映脑组织脂质过氧化程度，MDA浓度升高，表明脂质过氧化作用增加。SOD是氧自由基的清除剂，主要催化超氧阴离子生成HO，再由其他抗氧化酶如GSH-Px和过氧化氢酶作用生成水，其活性高低代表机体清除自由基能力，间接反映细胞损伤的程度，GSH-Px是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统，对防止体内自由基引起膜脂质过氧化损伤至关重要，SOD和GSH-Px两者之间明显存在着相互保护作用和协同抗氧化作用。本实验结果显示，芪红通络颗粒可明显减少缺血再灌注损伤后脑组织中MDA含量，显著升高SOD、GSH-Px活性，表明芪红通络颗粒具有较好的抗氧化作用。Nrf2/HO-1通路在抗氧化应激损伤中发挥重要作用。生理状态下Nrf2存在于细胞质中，并与肌动蛋白结合蛋白(Keap1)结合，不能进入细胞核发挥转录作用，当机体受到氧化应激时，Nrf2与Keap1解离并转位至细胞核，在核内Nrf2可与抗氧化反应组件结合，从而促进下游HO-1的转录。HO-1是一种重要的Ⅱ相解毒酶，可阻断游离血红素参加氧化反应，并将其代谢为胆绿素、一氧化碳和铁，从而在生物体内发挥抗氧化应激作用。研究已证实，激活Nrf2通路，上调Nrf2和HO-1蛋白表达水平可增强神经细胞对氧化应激的耐受性，从而减轻脑缺血再灌注后的氧化性损伤。脑缺血再灌注后机体由于保护性应激反应，可使Nrf激活，Nrf2和HO-1表达增加，但此反应持续时间短(72 h恢复到正常水平)，需要药物干预。本研究结果显示，在假手术组大鼠脑组织中，Nrf2和HO-1蛋白表达水平较低，模型组表达有所增加，但差异无统计学意义。芪红通络颗粒干预后，脑组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显升高，表明芪红通络颗粒具有激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制氧化应激反应的作用。

综上所述，芪红通络颗粒对大鼠CIRI具有明显的保护作用，其机制可能与其激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制氧化应激反应，从而产生抗氧化作用有关。