一种简单科学高效的桑白皮总黄酮含量测定方法

刘宇航，周伊宁，刘卫东，于海泉

(1.内蒙古医科大学，内蒙古自治区 呼和浩特 010100；2.内蒙古大唐药业股份公司，内蒙古自治区 呼和浩特 010010；3.内蒙古自治区蒙药新药研发企业重点实验室，内蒙古自治区 呼和浩特 010010)

桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.干燥根皮，始载于《神农本草经》，其性味甘寒，归肺脾经，具有泻肺平喘，行水消肿的功效[1]，主产于安徽、河南、浙江、江苏、湖南等地[2]。

20世纪70年代开始，野村太郎等人发现了桑白皮中的桑酮G等成分[3];桑白皮药材含量研究概述如下：徐世义等[4]以桑酮G为对照品的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。陈菁菁等[5]、董德刚等[6]、徐应淑等[7]、李洪娟等[8]、罗国庆等[9]、周锋[10]均以芦丁为对照品的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法方法；宗玉英等[11]以桑辛素为对照品，形成桑白皮药材高效液相色谱法含量测定方法；张国刚等[12]以桑酮G为对照品，确定了高效液相色谱法含量测定方法；王信等[13]以桑根酮C为对照品，用镁粉-盐酸法比色法测定桑白皮异戊烯基总黄酮得方法、采用HPLC法测定同时测定桑根酮C、D和桑辛素含量方法;谢体波等[14]，以自制摩鲁新L为对照品，以3% A1C13溶液为显色剂，形成桑白皮总黄酮含量方法；张蕾等[15]以芦丁为对照品，以A1C13溶液为显色剂，测定桑白皮总黄酮。

目前桑白皮总黄酮含量比色方法虽多，其中多数以芦丁为对照品。但据报道，桑白皮中不含有芦丁成分，所以该法专属性不强。高效液相法无法测定总黄酮；其他总黄酮方法，操作繁琐；现有测定桑白皮中抗骨质疏松高效成分异戊烯基总黄酮的含量的方法中只有王信等的以桑根酮C为对照品的镁粉-盐酸法，虽然专属高，但反应操作繁琐，反应剧烈、不易掌握。鉴于本课题以纯化桑白皮异戊烯基总黄酮为目的。综合考虑，我们试验了醋酸镁比色法，发现采用本实验的方法，以桑根酮C为对照品，是一种测定桑白皮中总黄酮的简便有效的方法。

1 材料与仪器

桑根酮C对照品(BaoJi Herbet Bio-Tech Co，Lot：HS052273198纯度≥98%)；桑白皮药材(内蒙古大唐药业股份有限公司)；桑白皮药材提取物(内蒙古大唐药业股份有限公司)；醋酸镁(北京北化精细化学品有限责任公司)和甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)为分析纯。

紫外可见分光光度仪(UV-2450，岛津公司，出厂编号：A10834201051)；万分之一天平(瑞士梅特勒天平公司，型号XPR10)；超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、FLEXA HP050二元梯度高压快速纯化制备色谱制备系统(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称定桑根酮C对照品适量，用甲醇溶解配成176.92μg/mL溶液，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

取桑白皮提取物0.10g，精密称定，置25mL量瓶中。加甲醇适量，超声(20℃、90%)20min，静置至室温，加甲醇定容到刻度，摇匀滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 检测波长的研究

精密量取2.1项下对照品溶液3mL，置10mL容量瓶中，加1%醋酸镁甲醇溶液定容到刻度，摇匀。精密量取2.2项下1mL供试品溶液，置50mL容量瓶中后加1%醋酸镁甲醇溶液定容到刻度，摇匀。用相应试剂做空白溶液，在200～800nm波长范围内扫描，结果见图1。

图1 桑白皮对照品和供试品紫外扫描图

由于最大吸收波长处的吸收峰，峰形非常尖锐，试验效果容易波动，引起较大的误差。故选择检测波长为接近最大吸收波长，位于两吸收峰之间的一个缓坡处的吸收峰处进行研究。故选择检测波长为293nm。

2.4 线性关系研究

精密量取2.1项下桑根酮C对照品溶液4、5、10、15、20mL，置100mL容量瓶中后加1%醋酸镁甲醇溶液定容，摇匀。用相应试剂为空白溶液，在293nm波长处测定紫外吸光度。以紫外吸光度为纵坐标，桑根酮C浓度(ug/mL)为横坐标作图，进行线性回归计算，得方程y=0.03872x-0.00676，r2=0.99975。说明在4.1180～24.7080ug/mL内线性关系满足要求。如图2。

图2 桑根酮C标准曲线

2.5 精密度研究

精密吸取2.1项下桑根酮C对照品溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。用相应试剂为空白溶液，在293nm波长处测定紫外吸光度，连续测定6次，记录紫外吸光度值，计算RSD。结果说明对照品溶液紫外吸光度的RSD为0.0534%(n=6)，说明仪器精密度非常好。

2.6 重复性研究

取同一批次的桑白皮提取物6份，按2.2项下确定方法制备供试品溶液，精密量取1mL供试品溶液，置100mL容量瓶中后加1%醋酸镁甲醇溶液定容至刻度，摇匀。用相应试剂做空白对照，在293nm波长处测定吸光度，计算供试品中总黄酮类化合物的含量及RSD。结果表明总黄酮类化合物含量为0.3544mg/mL，RSD为1.81%，说明本方法重复性较好。

2.7 稳定性研究

取一批次的桑白皮提取物，按2.2项下确定方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1mL，置100mL容量瓶中后加1%醋酸镁甲醇溶液定容至刻度，摇匀。用相应试剂做空白对照溶液，分别于0、30、60、90、120、150、180min在293nm波长处测定吸光度，计算RSD。结果表明供试品吸光度的RSD为1.83%，说明供试品在180min内是稳定的。

2.8 加样回收率研究

2.8.1对照品溶液的配置

取桑根酮C对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配置成82.36ug/mL。

2.8.2加样回收率研究

精密量取2.6项下各供试品溶液0.6mL和10mL对照品溶液，置100mL容量瓶中后加1%醋酸镁甲醇溶液定容到刻度，摇匀。用相应试剂为空白对照溶液，在293nm波长处测定吸光度，计算加样回收率及RSD。结果表明本方法平均回收率为95.95%，RSD为2.50%，说明本方法加样回收率符合规定。研究结果见表1。

表1 加样回收率考察结果表

2.9 桑白皮的提取及纯化后的样品含量测定

取3种方法提取分离的桑白皮提取物样品，按2.2项下确定的方法配制供试品溶液。精密量取各批次配制的溶液进行吸光度测定，并计算样品的含量。

表2 桑白皮提取及纯化后样品含量测定

3 讨论

桑白皮中的丰富黄酮类化合物，具有抗骨质疏松作用。测定结果说明通过大孔树脂-AB-8纯化效果好[16]。

常用的中药材总黄酮的紫外含量研究方法有盐酸-镁粉比色法[16]；Al(NO3)3比色法[17]；A1C13比色法[18]；NaOH比色法[19]；醋酸镁甲醇比色法[20]。本实验通过醋酸镁甲醇比色与目前已有的桑白皮中比色法方法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法、盐酸-镁粉比色法和A1C13比色法[21，22])对比分析，发现采用醋酸镁甲醇比色法，具有操作简单，反应温和，不需要加热等优势，可避免实验复杂操作带来的误差；显著提高桑白皮总黄酮含量测定的效率和准确性。

根据桑白皮药材、醇提物、醇提物上AB-8大孔树脂后提取物用水、不同浓度乙醇洗脱，含量测定结果分析，说明桑白皮异戊烯基总黄酮，药材含量很低，用60%乙醇提取是合适的，上大孔树脂后，水几乎洗不下来，大部分在50%～60%被洗脱下来，80%乙醇洗脱很少，但得到的提取物的却具有总黄酮纯度高的特点。